Morphological and Immunohystochemical Characteristics of Aspirated Thrombi in Patients with ST-Elevation Myocardial Infarction
- Authors: Sisakian HS1,2, Mkhitaryan AG1, Sahakyan VG1, Kocharyan AS1, Asatryan BA1
-
Affiliations:
- Yerevan State Medical University
- Clinic of General and Invasive Cardiology, University Hospital №1
- Issue: Vol 91, No 9 (2019)
- Pages: 21-25
- Section: Editorial
- URL: https://ter-arkhiv.ru/0040-3660/article/view/33587
- DOI: https://doi.org/10.26442/00403660.2019.09.000199
- ID: 33587
Cite item
Full Text
Abstract
Full Text
ИЛ - интерлейкин ЛЖ - левый желудочек ПАП - метод пероксидаза-антипероксидаза СЭФР - сосудистый эндотелиальный фактор роста ЧКВ - чрескожное коронарное вмешательство ЭКГ - электрокардиограмма iNOS - индуцибельная синтетаза оксида азота Острая окклюзия коронарной артерии в результате разрыва атеросклеротической бляшки, эрозии с последующим тромбообразованием приводят к развитию острого инфаркта миокарда с подъемом ST сегмента [1]. Ряд клеточных механизмов играет ключевую роль в развитии местного воспаления, активации тромбоцитов и формировании тромба [2]. Разрыв богатой липидами бляшки, который является серьезным тромбогенным провоцирующим механизмом, стимулирует скопление тромбоцитов. Вместе с тем адгезия и агрегация тромбоцитов вместе с формированием полимерной сети фибрина приводят к формированию тромба, который ограничивает локальный коронарный кровоток. Известно, что местная воспалительная реакция может способствовать развитию нестабильной бляшки [3]. Ряд исследований указывает, что эритроциты, нейтрофилы, моноциты, Т- и В-лимфоциты могут присутствовать в тромбе уже через несколько часов после начала симптомов [4-7]. Несмотря на данный факт, патофизиологическая роль различных субпопуляций клеток в процессе формирования коронарных тромбов остается не до конца выявленной. Морфологическая оценка клеточного состава коронарных тромбов может являться важным шагом к пониманию патофизиологии дестабилизации бляшки и формированию окклюзирующих тромбов. Чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) является золотым стандартом лечения пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента. Дополнительная аспирация тромба (тромбэктомия) выполняется по необходимости и дает возможность проведения морфологического анализа тромба [8]. В данном исследовании нашей целью было изучение морфологии и иммуногистохимических характеристик аспирированных тромбов у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента при коронарной ангиопластике и определение возможных патофизиологических механизмов, приводящих к активации тромбоцитов и вовлечению клеточных медиаторов воспаления в формировании коронарных тромбов. Материалы и методы Проведен проспективный скрининг всех пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента, которым проведено ЧКВ в период с января 2013 по апрель 2014 г. Диагноз острого инфаркта миокарда с подъемом ST сегмента поставлен больным, обратившимся в Университетскую клинику с симптомами ишемии миокарда и наличием боли более 30 мин, с обнаруженным подъемом сегмента ST>2 мм в двух смежных отведениях электрокардиограммы (ЭКГ), повышенным уровнем высокоспецифического тропонина-Т. Все ЧКВ проведены в соответствии с рекомендациями Европейского общества кардиологов по реваскуляризации миокарда при лечении острого инфаркта миокарда с подъемом ST сегмента в течение 12 ч от начала симптомов и достоверным подъемом сегмента ST [9, 10]. Больные, которым провели тромбоаспирацию, были включены в исследование. Клинические характеристики всех больных, включенных в исследование, приведены в таблице. Пациенты, у которых не удалось получить аспирированный тромб или аспирированные материалы не удалось проанализировать гистохимически, исключались из исследования. Все пациенты получали аспирин в начальной дозе 250 мг, клопидогрел в нагрузочной дозе 300-600 мг, гепарин 500 ЕД внутривенно в догоспитальном периоде или при поступлении в стационар. Инфаркт-зависимой артерией при ЧКВ считалась артерия, обеспечивающая кровоснабжение стенки левого желудочка (ЛЖ) с соответствующими отведениями ЭКГ-изменений с подъемом ST сегмента. Тромбоаспирация проводилась пациентам, если тромб визуализировался после коронарной ангиографии до использования каких-либо интервенционных вмешательств, кроме коронарного проводника и инструментов для тромбэктомии. Решение о проведении тромбоаспирации принималось инвазивным кардиологом исходя из коронароангиографической характеристики. Никто из пациентов не получал тромболитической терапии или ингибиторов IIb/IIIa гликопротеиновых рецепторов до проведения коронарной ангиопластики. Аспирированные тромбы немедленно фиксировали в 10% растворе нейтрального буферного формалина. Материалы, включающие парафин, неоднократно рассекались и помещались на предметное стекло. Срезы окрашивали при помощи гематоксилина и эозина для световой микроскопии. Визуализация фибрина проводилась методом окраски Picro-Malory. С целью исследования клеточных компонентов и активированных тромбоцитов использован иммуногистохимический метод ПАП (пероксидаза-антипероксидаза) с помощью моноклональных антител к CD4, CD8, CD15, CD63 и CD105, с использованием диаминобензидина в качестве визуализирующего агента (Spring Bioscience). Для визуализации фибрина срезы окрашивались методом Picro-Malory. Использованы следующие первичные антитела (Spring Bioscience): CD15 (дилюция 1:50, клон SP159, моноклональный кролик), CD105 (дилюция 1:50, клон N/A, поликлональный кролик), антитела к фактору роста сосудистого эндотелия (дилюция 1:100, клон SP28, моноклональный кролик), антитела к индуцибельной синтетазе оксида азота (iNOS) (дилюция 1:100, клон SP28, моноклональный кролик), CD63 (дилюция 1:200, клон SPM524, моноклональная мышь), CD4 (дилюция 1:50, клон SP35, моноклональный кролик) и цитотоксические Т-лимфоциты (CD8) (дилюция 1:100, клон SP16, моноклональный кролик) стандартным ПАП методом, с последующей визуализацией с определением активности пероксидазы на основе реакции диаминобензидина с использованием системы детекции HRP DAB. Также исследовали анти-NOS и анти-СЭФР (сосудистый эндотелиальный фактор роста) антитела. При статистическом анализе переменные выражены в процентах. Протокол исследования одобрен комитетом этики Ереванского государственного медицинского университета. Результаты В целом собраны и исследованы тромбы, полученные от 67 пациентов. Макроскопический анализ выявил рыхлые тромбы, которые впоследствии при микроскопии представлены с видимыми слоями (lines of Zahn), тромбоцитов и депозитами фибрина, чередующиеся темными слоями эритроцитов. Микроскопический анализ тромбов выявил также рыхлую сетчатую структуру волокон фибрина с компактными скоплениями CD63 положительных клеток (рис. 1, см. на цветной вклейке). Тромбоциты были окружены нейтрофильными гранулоцитами, местами с обширными очагами микроабсцесс-подобной аккумуляции. Агрегаты содержали небольшое количество дегенерированных эритроцитов, которые встречались на фибринной нити в качестве зон аккумуляции групп клеток с сохранной морфологией (рис. 2, см. на цветной вклейке). Иммуногистохимический анализ выявил агрегаты клеток, состоявших из CD63 положительных активированных тромбоцитов. В цитоплазме окружающих нейтрофилов обнаружены азурофильные включения (гранулы), положительные к CD63 [11]. Помимо CD63 положительных, гранулоциты были также положительны к CD15-антигену, так же известному как Leu-M1 и Lewis X антигены, которые играют роль в активации фагоцитов и хемотаксисе [12] (рис. 3, см. на цветной вклейке). Иммуногистохимический анализ, направленный на выявление CD8 и CD4, выявил наличие CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и CD4+ T-хелперных лимфоцитов (рис. 4, см. на цветной склейке). В анализированных тромбах не выявлено экспрессии iNOS, CD105 и СЭФР. Обсуждение Патофизиологические механизмы, приводящие к развитию атеросклероза и тромбоза, представляют многосторонние изменения, включающие воспаление, эндотелиальную дисфункцию и активацию тромбоцитов. Тромбоцитарно-лейкоцитарное взаимодействие с последующим формированием тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов, по данным ряда исследований, играет важную роль в развитии нестабильной бляшки и острого коронарного синдрома [13, 14]. Активация тромбовоспалительного ответа может провоцировать развитие нестабильной атеросклеротической бляшки, агрегацию тромбоцитов, активацию провоспалительных цитокинов и ряда факторов, способствующих тромбообразованию [15]. Активация тромбоцитов с последующим высвобождением биологически активных субстанций может спровоцировать также адгезию нейтрофилов к воспаленному эндотелию [16]. Ряд исследований показал, что альфа-гранулы тромбоцитов содержат адгезивные протеины, факторы коагуляции и ангиогенеза, такие как тромбоцитарный фактор 4 и Р-селектин, которые могут иметь вклад или даже играть ключевую роль в формировании тромба [17]. Тем не менее большинство предыдущих исследований были сосредоточены на гистологических характеристиках описания тромбов, в то время как иммуногистохимическая оценка для выявления возможных клеточных факторов, вовлеченных в развитие тромбогенеза, не проводилась [7, 18, 19]. Принимая во внимание вышеперечисленные клеточные патофизиологические механизмы, мы изучили морфологические характеристики тромбов у пациентов с коронарным атеротромбозом, приводящим к острому инфаркту миокарда с подъемом ST сегмента. Результаты нашего исследования демонстрируют наличие активированных тромбоцитов и компонентов эритроцитов в аспирированных тромбах у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента, используя иммуногистохимический анализ клеточных антигенов с окраской. Хотя предыдущие исследования выявили наличие тромбоцитов, сети фибрина, эритроцитов и лейкоцитов в коронарных тромбах, наличия активированных и CD63 позитивных тромбоцитов непосредственно в коронарных тромбах при тромбэктомии не выявлено [2, 6, 20]. Прогресс в технике проведения тромбэктомии позволил нам провести более детальную оценку морфологических и иммуноморфологических характеристик компонентов тромбов. Проведенное нами исследование продемонстрировало, что тромбы в коронарных артериях богаты тромбоцитами и эритроцитами, а положительная окраска CD63-антигена в тромбах указывает на возможное участие мегакариоцитов, в частности активированных тромбоцитов, в формировании коронарных тромбов, поскольку отрицательная реакция на CD105-антиген для выявления гранулоцитов может указать на более вероятное наличие тромбоцитов. В неактивных тромбоцитах CD63 присутствует лишь на мембранах плотных гранул и лизосом и перемещается в цитоплазматическую мембрану в результате активации тромбоцитов и экзоцитоза, где соединяется с комплексом интегринов тромбоцитов альфа-IIBбета3-CD9 и актином цитоскелета в альфа-IIBбета3-зависимой форме [21]. Данный процесс приводит к экспрессии CD63 на цитоплазматической мембране [22]. В исследовании K. Arakawa и соавт. степень аккумуляции нейтрофилов в аспирированных тромбах у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента являлась независимым предиктором резолюции ST сегмента и функции ЛЖ через 6 мес [23]. В нашем исследовании мы обнаружили в аспирированных тромбах гранулоциты, положительные к CD15, что свидетельствует о наличии активности воспалительной локальной реакции. Гистохимический анализ продемонстрировал также наличие CD8+ и CD4+-лимфоцитов в коронарных тромбах, что свидетельствует о возможном вовлечении активированных лимфоцитов в формировании тромба. В атеросклеротической бляшке найдены Т-лимфоциты (и CD4+-хелперы, и цитотоксические CD8+) наряду с макрофагами. Данные из нескольких исследований на животных продемонстрировали, что специализированные Т- и В-клетки могут иметь как провоцирующие, так и стимулирующие эффекты на атеросклероз [24]. В частности, Т-клетки могут играть важную роль во взаимодействии между сосудами и иммунной системой посредством усиления воспаления в стенке сосуда и развития атеросклероза. Выдвинутая ранее теория, что сосудистое воспаление может являться важным фактором развития атеросклероза, привела к осуществлению клинических исследований по изучению фармакологического воздействия на воспалительные цитокины, интерлейкин (ИЛ)-1 (на которые таргетно действует каналикумаб - человеческие моноклональные анти-ИЛ-1b антитела в исследовании CANTOS), ИЛ-6 и фактор некроза опухоли-β [на которые таргетно действуют малые дозы метотрексата в исследовании Cardiovascular Inflammation Reduction Trial (CIRT trial)] [25]. Ограничения в проведенном нами исследовании: решение о проведении тромбоаспирации принималось интервенционными кардиологами Клиники общей и инвазивной кардиологии университетской больницы №1 и, следовательно, не было протокола по предварительной селекции кандидатов среди всех пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента. Данные о начале ангинозных болей основаны на субъективном описании пациентов, что в ряде случаев может усложнить определение точного начала процесса тромбообразования. Таким образом, несмотря на наличие ST элевации на ЭКГ, которая считается наиболее объективным маркером начала инфаркта миокарда и окклюзии коронарной артерии, давность тромба определить сложно, так как точное время развития окклюзирующего тромба из неокклюзирующего может не соответствовать клинической манифестации острого инфаркта миокарда с подъемом ST сегмента. Заключение Гистопатологический анализ тромбов у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента выявил наличие активированных CD63+-тромбоцитов и CD15+-нейтрофильных гранулоцитов. Наличие клеток CD4+ и CD8+ может свидетельствовать о вовлечении в патофизиологический процесс формирования тромба активированных лимфоцитов и требует дальнейших исследований. Полученные данные показывают, что активированные тромбоциты и нейтрофилы могут быть важными факторами, вовлеченными в процесс тромбовоспалительной активации, приводящей к дестабилизации атеросклеротической бляшки и развитию острого тромбоза у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом ST сегмента. Дальнейшие исследования в этом направлении должны уточнить потенциальную роль активированных тромбоцитов в провоцировании тромбовоспалительного ответа, что улучшит понимание процесса формирования тромба. Выявление механизмов, лежащих в основе тромбообразования, в дальнейшем поможет в разработке новых терапевтических возможностей для предотвращения развития тромбоза у пациентов с ишемической болезнью сердца. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.About the authors
H S Sisakian
Yerevan State Medical University; Clinic of General and Invasive Cardiology, University Hospital №1
Email: hamayak.sisakian@doctor.com
Yerevan, Armenia
A G Mkhitaryan
Yerevan State Medical UniversityYerevan, Armenia
V G Sahakyan
Yerevan State Medical UniversityYerevan, Armenia
A S Kocharyan
Yerevan State Medical UniversityYerevan, Armenia
B A Asatryan
Yerevan State Medical UniversityYerevan, Armenia
References
- Davies M.J & Thomas A.C. Plaque fissuring - the cause of acute myocardial infarction, sudden ischaemic death, and crescendo angina. Br Heart J. 1985;53(4):363-73.
- Srikanth S & Ambrose J.A. Pathophysiology of coronary thrombus formation and adverse consequences of thrombus during PCI. Curr Cardiol Rev. 2012;8(3):168-76. doi: 10.2174/157340312803217247
- Hansson G.K, Libby P., Tabas I. Inflammation and plaque vulnerability. J Intern Med. 2015;278(5):483-93. doi: 10.1111/joim.12406
- Ramaiola I, Padro T, Pena E, Juan-Babot O, Cubedo J, Martin-Yuste V, et al. Changes in thrombus composition and profilin-1 release in acute myocardial infarction. Eur Heart J. 2015;36(16):965-75. doi: 10.1093/eur heartj/ehu356
- Sadowski M, Zabczyk M., Undas A. Coronary thrombus composition: links with inflammation, platelet and endothelial markers. Atherosclerosis. 2014;237(2):555-61. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2014.10.020
- Silvain J, Collet J.P, Nagaswami C, Beygui F, Edmondson K.E, Bellemain-Appaix A, et al. Composition of coronary thrombus in acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2011;57(12):1359-67. doi: 10.1016/j.jacc.2010.09.077
- Yunoki K, Naruko T, Sugioka K, Inaba M, Iwasa Y, Komatsu R, et al. Erythrocyte - rich thrombus aspirated from patients with ST-elevation myocardial infarction: association with oxidative stress and its impact on myocardial reperfusion. Eur Heart J. 2012;33(12):1480-90. doi: 10.1093/ eurheartj/ehr486
- Кашталап В.В., Завырылина И.Н., Барбараш О.Л. Эндоваскулярная реваскуляризация при остром коронарном синдроме с подъемом сегмента ST в России: проблемы и перспективы дальнейшего развития. Креативная кардиология. 2015;3:5-15.
- Windecker S, Kolh P, Alfonso F, Collet J.P, Cremer J, et al. 2014 ESC/EACTS Guidelines on myocardial revascularization: The Task Force on Myocardial Revascularization of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Association for Cardio-Thoracic Surgery (EACTS)Developed with the special contribution of the European Association of Percutaneous Cardiovascular Interventions (EAPCI). Eur Heart J. 2014;35(37):2541-619. doi: 10.1093/eurheartj/ehu278
- Ibanez B, James S, Agewall S, Antunes M.J, Bucciarelli-Ducci C, Bueno H, et al. Group ESCSD. 2017 ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J. 2017. doi: 10.1093/eurheartj/ehx393
- Cham B.P, Gerrard J.M, Bainton D.F. Granulophysin is located in the membrane of azurophilic granules in human neutrophils and mobilizes to the plasma membrane following cell stimulation. Am J Pathol. 1994:144(6): 1369-80.
- Kerr M.A & Stocks S.C. The role of CD15-(Le(X))-related carbohydrates in neutrophil adhesion. Histochem J. 1992;24(11):811-26.
- Furman M.I, Barnard M.R, Krueger L.A, Fox M.L, Shilale E.A, Lessard D.M, et al. Circulating monocyte - platelet aggregates are an early marker of acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2001;38(4):1002-6.
- Michelson A.D, Barnard M.R, Krueger L.A, Valeri C.R, Furman M.I. Circulating monocyte - platelet aggregates are a more sensitive marker of in vivo platelet activation than platelet surface P-selectin: studies in baboons, human coronary intervention, and human acute myocardial infarction. Circulation. 2001;104(13):1533-7.
- Тращенко А.С. Клинико - иммунологические особенности течения инфаркта миокарда с зубцом Q: дис. … канд. мед. наук. Кемерово, 2010:122 с.
- Duerschmied D, Suidan G.L, Demers M, Herr N, Carbo C, Brill A, et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 2013;121(6):1008-15. doi: 10.1182/blood-2012-06-437392
- Shi G, Field D.J, Long X, Mickelsen D, Ko K.A, Ture S, et al. Platelet factor 4 mediates vascular smooth muscle cell injury responses. Blood. 2013;121(21):4417-27. doi: 10.1182/blood-2012-09-454710
- Kramer M.C, van der Wal A.C, Koch K.T, Rittersma S.Z, Li X, Ploegmakers H.P, et al. Histopathological features of aspirated thrombi after primary percutaneous coronary intervention in patients with ST-elevation myocardial infarction. PLoS One. 2009;4(6): e5817. doi: 10.1371/journal. pone.0005817
- Rittersma S.Z, van der Wal A.C, Koch K.T, Piek J.J, Henriques J.P, Mulder K.J, et al. Plaque instability frequently occurs days or weeks before occlusive coronary thrombosis: a pathological thrombectomy study in primary percutaneous coronary intervention. Circulation. 2005;111(9):1160-5. doi: 10.1161/01.CIR.0000157141.00778.AC
- Kovacs A, Sotonyi P, Nagy A.I, Tenekedjiev K, Wohner N, Komorowicz E, et al. Ultrastructure and composition of thrombi in coronary and peripheral artery disease: correlations with clinical and laboratory findings. Thromb Res. 2015;135(4):760-6. doi: 10.1016/j.thromres.2015.02.004
- Nishibori M, Cham B, Mc Nicol A, Shalev A, Jain N & Gerrard J.M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J Clinical Investigation. 1993;91(4):1775-82.
- Israels S.J & Mc Millan-Ward E.M. CD63 modulates spreading and tyrosine phosphorylation of platelets on immobilized fibrinogen. Thromb Haemost. 2005;93(2):311-8. doi: 10.1160/TH04-08-0503
- Arakawa K, Yasuda S, Hao H, Kataoka Y, Morii I, Kasahara Y, et al. Significant Association Between Neutrophil Aggregation in Aspirated Thrombus and Myocardial Damage in Patients With ST-Segment Elevation Acute Myocardial Infarction. Circulation. 2009;73(1):139-44. doi: 10.1253/circj.CJ-08-0609
- Ammirati E, Moroni F, Magnoni M, Camici P.G. The role of T- and B-cells in human atherosclerosis and atherothrombosis. Clin Exp Immunol. 2015;179(2):173-87. doi: 10.1111/cei.12477
- Sparks J.A, Barbhaiya M, Karlson E.W, Ritter S.Y, Raychaudhuri S, Corrigan C.C, et al. Investigating methotrexate toxicity within a randomized double - blinded, placebo - controlled trial: Rationale and design of the Cardiovascular Inflammation Reduction Trial-Adverse Events (CIRT-AE) Study. Semin Arthritis Rheum. 2017;47(1):133-42. doi: 10.1016/j. semarthrit.2017.02.003