Ассоциативная связь полиморфизмов HLA-DRB1 и TNFA-308 A/G с деструктивным поражением суставов у больных ранним ревматоидным артритом с высокой воспалительной активностью заболевания (исследование РЕМАРКА)

Полный текст

АЦЦП - антитела к циклическим цитруллинированным пептидам БПВП - базисные противовоспалительные препараты ВГН - верхняя граница нормы ГИБП - генно-инженерный биологический препарат МТ - метотрексат ОШ - отношение шансов ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ - ПЦР в режиме реального времени РА - ревматоидный артрит РРА - ранний РА РФ - ревматоидный фактор СРБ - C-реактивный белок ФНО- α - фактор некроза опухоли-α ЧПС - число припухших суставов IgM - иммуноглобулин М Ревматоидный артрит (РА) - хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани, характеризующееся деструктивным поражением суставов, в патогенезе которого значительную роль играют аутоиммунные механизмы [1]. РА относится к большой группе мультифакториальных, полигенных заболеваний, которые характеризуются вовлеченностью в формирование предрасположенности к болезни и выраженный клинический полиморфизм многих генов. Для идентификации пациентов с РА на ранней стадии болезни разработаны критерии ACR/EULAR 2010 г. [2], что позволило начинать лечение как можно раньше, следуя стратегии «Лечения до достижения цели» (“Treat to target”). Основная цель такого подхода - достижение клинической ремиссии или низкой активности заболевания. Однако необходимо подчеркнуть, что у пациентов с одинаковым диагнозом наблюдается межиндивидуальная вариабельность клинических, лабораторных, инструментальных и функциональных параметров как в момент постановки диагноза, так и в процессе лечения. В частности, у ряда пациентов наблюдается быстрое рентгенологическое прогрессирование суставного процесса с разрушением хряща и образованием эрозий, несмотря на проводимое лечение, что может приводить к функциональной недостаточности уже на ранних стадиях РА. В семейных и популяционных исследованиях показано, что не только предрасположенность к развитию РА, но и степень деструктивного поражения суставов, продукции антител к циклическим цитруллинированным пептидам (АЦЦП), ревматоидного фактора РФ генетически детерминированы [3-6]. Наиболее значимым генетическим маркером прогрессирования деструктивного поражения суставов является ген HLA-DRB1, точнее, некоторые его аллели, которые обозначают как Shared Epitope, SE-общий, схожий эпитоп, который кодируется аллелями *01:01, *01:02, *04:01, *04:04, *04:05, *04:08, *14:02, *10 [7, 8]. Всего в системе гистосовместимости человека HLA идентифицировано 200-220 генов, 30-40% из которых принимают участие в реализации иммунного ответа. Одним из ключевых цитокинов, играющих центральную роль в патогенезе РА, является интерлейкин TNF-α [фактор некроза опухоли (ФНО-α)], который кодируется геном TNFA и который, в свою очередь, картируется в регионе класса III системы HLA. В силу выраженного неравновесия по сцеплению (физически близкое расположение более 200 генов на участке ≈6 килобаз) образуются устойчивые гаплотипы. Наиболее известным является HLA-A1; B8; DR3; DQ2. Кроме того, установлено, что аллель HLA*03 ассоциирован с аллелем А полиморфного варианта гена TNFА(-308G>A). Данные о взаимосвязи наиболее хорошо изученного полиморфизма TNFА(-308G>A) в рентгенологической суставной деструкции противоречивы. Цель нашего исследования заключалась в изучении взаимосвязи аллелей гена HLA-DRB1 и полиморфизма TNFА(-308G>A) независимо друг от друга или в комбинации с деструктивным поражением суставов и его прогрессированием в течение 12 мес у больных с ранним (<6 мес), активным, преимущественно АЦЦП и РФ-позитивным РА, леченным согласно стратегии «Treat to target». Материалы и методы Исследование проведено в рамках программы РЕМАРКА (Российское исслЕдование МетотрексАта и биологических препаратов при Раннем аКтивном Артрите). В исследование включены 85 больных ранним РА (РРА) с длительностью симптомов не более 6 мес. Диагноз РА ставился по критериям ACR/EULAR 2010 г. Необходимые условия для включения пациентов в исследование: высокая активность заболевания [SDAI≥11, число припухших суставов (ЧПС) ≥3, СОЭ по Вестергрену ≥28 мм/ч или C-реактивный белок (СРБ) ≥10 мг/л]; наличие прогностических неблагоприятных факторов (обнаружение АЦЦП, иммуноглобулина М (IgM) РФ, эрозий по данным рентгенографии, значение индекса HAQ); отсутствие терапии базисными противовоспалительными препаратами (БПВП) к моменту включения пациентов в исследование. Всем пациентам первоначально назначен метотрексат (МТ) с быстрой эскалацией дозы до 20-25 мг/нед. При неэффективности назначали комбинированную терапию МТ+ГИБП, главным образом адалимумаб. Каждые 3 мес эффективность терапии контролировали по индексам активности DAS28, SDAI, CDAI. Степень деструктивного поражения суставов оценивали в момент включения в исследование (85 человек) и через 12 мес наблюдения (68 человек). Для оценки прогрессирования изменений в суставах при РА использовали метод Sharp в модификации van der Heijde. Оценивались суставы кистей и дистальных отделов стоп. Максимальный общий счет (модифицированный счет Шарпа) представлял собой суммирование баллов по эрозиям и сужениям суставных щелей. Прогрессирование суставной деструкции оценивали у каждого пациента как разность баллов (∆ счета эрозий, ∆ счета сужений суставных щелей и ∆ общего счета), измеренных при включении в исследование и через 12 мес. Кроме того, прогрессия оценивалась как дихотомичная вариабельность (есть/нет), при этом наличие прогрессии регистрировали, если имелись изменения в счете баллов (Δ=1,0 балл) при оценке рентгенограмм между временными точками 0-12 мес. Геномная ДНК выделена методом солевой экстракции с использованием хлорида натрия. Для базового низкоразрешающего генотипирования локуса HLA-DRB1 на уровне групп аллелей использовали метод на основе классической методики сиквенс-специфических праймеров (Sequence Specific Primers, SSP), модифицированной для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ; НПФ «ДНК-Технология»). Разработанная тест-система представляла собой 13 комплектов реагентов, предназначенных соответственно для выявления в образце следующих групп аллелей локуса HLA-DRB1: *01, *15(*02), *16(*02), *03, *04, *11(*05), *12(*05), *13(*06), *14(*06), *07, *08, *09, *10. Накопление продуктов амплификации регистрировали с помощью флюоресцентно-меченого зонда типа Taq-man®, расположенного на участке второго экзона локуса HLA DRB1, общего для всех групп аллелей. ПЦР, детекцию продуктов амплификации в режиме РВ и интерпретацию полученных результатов проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) и программного обеспечения к нему. Высокоразрешающее генотипирование аллелей DRB1*04, позволяющее «прочитать» последовательность нуклеотидов и точно определить аллель до 4-8 знаков после значка «*» (например, DRB1*040101, *0404) осуществлено на секвенаторе 3130I Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Экзон 2-го гена DRB1 амплифицирован с использованием групп специфических праймеров с последующим секвенированием ампликонов. Генотипирование полиморфизма гена TNFА(-308G>A, rs1800629) выполнено методом ПЦР-РВ (PCR-RT) с использованием оригинальных сиквенс-специфических праймеров и проб, меченных различными флюоресцентными метками (НПФ «ДНК-Технология»). Автоматическую регистрацию и интерпретацию полученных результатов проводили на отечественном инновационном детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ООО «ДНК-Технология»). Генотипирование проводили согласно инструкции фирмы-изготовителя наборов. При проверке работоспособности созданных тест-систем в качестве референсного метода определения генотипа образцов использовали автоматическое секвенирование ДНК по Сэнгеру с применением автоматического секвенатора ABI PRISM®310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Определение концентрации АЦЦП 2 проводили иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора фирмы «Axis-Shield Diagnostic Limited» (Великобритания) согласно инструкции фирмы-производителя, верхняя граница нормы (ВГН) - 5 Ед/мл. Больных с уровнем продукции АЦЦП > 5 Ед/мл относили в группу АЦЦП-позитивных лиц, с уровнем продукции ≤ 5 Ед/мл - в группу АЦЦП-негативных лиц. Также АЦЦП определяли электрохемилюминесцентным методом (Cobas e411), ВГН - 17 Ед/мл. Определение IgM РФ проводили методом иммунонефелометрии на автоматическом анализаторе BN-100 (Dade Behring, Германия), ВГН - 15 МЕ/л. Больные с уровнем продукции IgM РФ >15 МЕ/л отнесены в группу РФ-позитивных лиц, с уровнем продукции ≤15 МЕ/л - в группу РФ-негативных лиц. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ SPSS 17.0 с включением методов параметрического и непараметрического анализов. Для вариабельностей с нормальным распределением подсчитаны средние величины (means - M) и среднеквадратичные отклонения (Standard Deviations - SD), t-критерий использован для сравнения двух выборок. При асимметричном распределении вариабельностей данные представлены как медиана и межквартильный размах. Для сравнения двух независимых выборок использовали критерий Манна-Уитни, для сравнения двух зависимых выборок - критерий Вилкоксона. При сравнении трех и более независимых выборок использовали критерий Краскала-Уоллеса. Для оценки информативности генетических маркеров (аллели гена HLA-DRB1 и полиморфизм гена TNFA-308G/A) в качестве предикторов прогрессирования эрозивного процесса как бинарной переменной использован метод логистической регрессии. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05. Результаты Демографическая, клинико-лабораторная, рентгенологическая и молекулярно-генетическая характеристики больных РРА при включении в исследование представлены в табл. 1. Обследованы 85 пациентов (19 мужчин, 66 женщин). Возраст больных варьировал от 20 до 74 лет и в среднем составил 52,0±12,9 года. В группе преобладали женщины - 66 (77,6%), соотношение мужчин и женщин равнялось 1:3,5. Средняя продолжительность заболевания на момент включения в исследование составила 4,1±1,4 мес (от 1 до 6 мес). Подавляющее число больных являлись АЦЦП (79/85) и РФ (80/85) позитивными. Количественные значения АЦЦП оказались высоки: у подавляющего числа пациентов концентрация достигала 50 Ед/мл и выше. При включении в исследование эрозии выявлены у 35 (41,2%) из 85 пациентов, через 12 мес - у 30 (44,1%) из 68 пациентов. Сужение суставных щелей наблюдалось у 82 (96,5%) из 85 и у 84 (98,8%) из 85 пациентов на момент включения в исследование и через 12 мес динамического наблюдения. Базовые количества эрозий, сужения суставных щелей и общий счет по Шарпу в баллах представлены в табл. 1. Аллели HLA-DRB1*(SE+) определялись у 56 (65,8%) пациентов, из них двойная доза SE (SE+/SE+) выявлена у 15 (17,6%) и одна копия SE (SE+/SE-) - у 41 (48,2%) пациента (см. табл. 1). Генотип TNFA- 308GG обнаружен у 64 (75,3%) пациентов и генотип GА - у 21 (24,7%) пациента. Генотип АА не выявлен ни у одного пациента (см. табл. 1). В табл. 2 представлены значения счета эрозий, сужений суставных щелей, общего счета по Шарпу, стратифицированных по генотипам гена TNFA. При включении в исследование и через 12 мес проспективного наблюдения значения счета эрозий не различались у носителей генотипов GG и GA (p>0,05). В то же время сужение суставных щелей и общего счета по Шарпу значительно коррелировало с генотипами гена TNFA. Базовые значения числа сужений и общего счета по Шарпу у носителей генотипа GG почти в два раза превышали таковые у носителей генотипа GA (p<0,005 и p<0,004 соответственно). Аналогично через 1 год значения числа сужений и общего счета по Шарпу у носителей генотипа GG в два раза превышали таковые у носителей генотипа GA (p<0,007 и p<0,002 соответственно). Необходимо отметить, что прогрессирование деструкции суставов, оцененное как ∆ сужения суставных щелей и общего счета Шарпа, не ассоциировано с полиморфизмом гена TNFA (p>0,05) через 12 мес проспективного исследования. Кроме того, мы проанализировали, усиливается ли взаимосвязь комбинации аллелей HLA-DRB1*03 и аллелей TNFA (GG/DRB1*03+, GG/DRB1*03-, GA/DRB1*03+, GA/DRB1*03-) с прогрессированием деструкции суставов. Анализ показал, что ни одна комбинация не увеличивала взаимосвязь с рентгенологическими изменениями по сравнению с генотипами TNFA. В табл. 3 представлены данные по счету эрозий, сужению суставных щелей, общему счету по Шарпу, а также прогрессированию суставного процесса, оцененному как ∆ вышеперечисленных показателей в зависимости от носительства генотипов HLA-DRB1*(SE). Пациентов разделили на две группы: 1) носители двойной дозы SE (SE+/SE+); 2) носители или одной дозы SE (SE+/SE-) или аллелей HLA-DRB1, не относящихся к SE (SE-/SE-). Как следует из табл. 3, число эрозий, сужений суставных щелей и общий счет по Шарпу как при включении в исследование, так и через 12 мес не ассоциированы с носительством и дозой аллелей SE (p>0,05). Однако прогрессирование деструктивного поражения суставов, оцененное как изменение (∆) числа эрозий, сужений суставных щелей и общего счета статистически значимо ассоциировано с генотипами HLA-DRB1*(SE): у носителей двойной дозы SE (SE+/SE+) прогрессирование выражено значительнее по сравнению с таковым у носителей (SE+/SE-)/(SE-/SE-). Логистический регрессионный анализ также выявил взаимосвязь прогрессирования деструкции суставов (эрозирование, общий счет по Шарпу), как бинарных переменных, с наличием в генотипе больного двойной дозы SE+. Показатели отношения шансов (ОШ) оказались практически одинаковыми при оценке прогрессирования по изменению счета баллов по эрозиям и общему счету по Шарпу (ОШ=4,1 [1, 1-17, 6], p=0,05). Это объясняется тем, что прогрессирование в большей мере связано с увеличением числа эрозий, но не числа сужений суставных щелей. Нами проанализирована дополнительно взаимосвязь позитивности по АЦЦП и РФ как бинарных переменных с рентгенологическими показателями деструкции суставов и генотипами генов TNFA и HLA-DRB1 (SE+). Никаких статистически значимых взаимосвязей иммунологических показателей с инструментальными и молекулярно-генетическими параметрами не обнаружено. Обсуждение РА относится к большой группе мультифакториальных, полигенных заболеваний, которые характеризуются вовлеченностью в формирование предрасположенности к болезни и выраженный клинический полиморфизм многих генов. Вполне вероятно, что гены или их полимофные варианты могут быть ассоциированы не только с предрасположенностью к развитию заболевания, но и его отдельными фенотипами. До сих пор деструктивное поражение суставов является практически неотъемлемым признаком РА, хотя у пациентов это проявление болезни носит чрезвычайно вариабельный характер. Ранее во многих исследованиях показана важная роль аллелей гена HLA-DRB1(SE+) в качестве генетического маркера неблагоприятного прогноза прогрессирования деструкции суставов [9, 10], хотя ряд исследователей полагают, что такая взаимосвязь обусловлена тесной ассоциацией аллелей HLA-DRB1(SE) с АЦЦП, которые и предопределяют тяжелое течение болезни. В нашем исследовании практически все больные являлись АЦЦП-позитивными, причем с очень высокими титрами аутоантител (выше трех норм). Однако деструктивное поражение суставов, в частности эрозирование, развилось лишь у части пациентов. Поскольку наша выборка больных с ранним активным РА характеризовалась чрезвычайно высокой частотой позитивности по АЦЦП и РФ (условие включения пациента в исследование), мы ожидали, что и частота аллелей SE+ также будет более высокой. К нашему удивлению, распределение генотипов HLA-DRB1 (SE+/SE+, SE+/SE-, SE-/SE-) не отличалось от такового в выборке больных из исследования РАДИКАЛ (21,1, 40,6, 38,3% соответственно), которая характеризовалась более низкой частотой позитивности по АЦЦП и РФ (61,0 и 67,0% соответственно) [11]. Можно предположить, что прямая взаимосвязь аллелей гена HLA-DRB1 с продукцией АЦЦП не является столь очевидным фактом. Несмотря на проводимое лечение согласно принципу «Treat to target», причем начатое на ранней стадии заболевания, у больных с активным РА наблюдалось некоторое прогрессирование деструкции суставов. Такая прогрессия связана скорее с увеличением числа эрозий, чем числа сужений суставных щелей. Мы выявили статистически значимую взаимосвязь прогрессирования деструкции суставов по Шарпу с генотипами гена HLA-DRB1(SE+). В то же время полиморфизм гена TNFA-308G/A статистически значимо ассоциирован с сужением суставных щелей и общим счетом по Шарпу как при включении больных в исследование, так и через 1 год динамического наблюдения. Однако необходимо отметить, что на фоне лечения согласно принципу «Treat to target» прогрессирования сужения щелей и общего счета по Шарпу не наблюдалось. В литературе мы не обнаружили исследований, посвященных изучению взаимосвязи полиморфизмов генов HLA-DRB1 и TNFA-308G/A с деструктивным поражением суставов и его прогрессированием в ходе лечения больных РА согласно стратегии «Treat to target». В более ранних исследованиях ассоциативная связь выше перечисленных полиморфизмов с деструкцией суставов тестировалась у больных с ранним РА, леченных базисными противовоспалительными препаратами. В 5-летнем проспективном исследовании D. Khanna и соавт. выявлена ассоциация генотипов AA/AG с более высокой степенью прогрессирования эрозий, сужения суставных щелей и общим счетом по Шарпу по сравнению с генотипом GG. Ассоциативная взаимосвязь полиморфизма гена HLA-DRB1 и совместных генотипов HLA-DRB1 и TNFA-308G/A с деструктивным поражением суставов и его прогрессированием не обнаружена [12]. Исследования A.H. van der Helm-van Mil и соавт. и S. Reneses и соавт. не выявили взаимосвязь степени деструктивного поражения суставов с полиморфизмом TNFA-308G/A [13, 14]. Заключение Полученные результаты свидетельствуют, что полиморфизм гена HLA-DRB (SE+) ассоциирован с прогрессированием деструктивного поражения суставов через 12 мес лечения. В то же время полиморфизм TNFА(-308G>A) ассоциирован с базовыми значениями сужения суставов и общим счетом по Шарпу, но не прогрессированием суставного процесса у больных с ранним, активным РА после 12 мес лечения согласно стратегии «Treat to target».

Об авторах

Ирина Анатольевна Гусева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»

Email: irrgus@yandex.ru
к.м.н., с.н.с.; ORCID ID orcid.org/0000-0002-4906-7148

Александр Викторович Смирнов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»

д.м.н., зав. лаб.

Наталья Викторовна Демидова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»

к.м.н., н.с.

Михаил Юрьевич Крылов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»

к.м.н., ст.н.с.

Анастасия Сергеевна Авдеева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»

к.м.н., н.с.

Елена Юрьевна Самаркина

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»

м.н.с.

Елена Львовна Лучихина

ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

к.м.н., в.н.с.

Дмитрий Евгеньевич Каратеев

ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

д.м.н., гл. н.с.

Дмитрий Дмитриевич Абрамов

ФГБУ «Государственный научный центр Институт иммунологии» ФМБА России

к.б.н., в.н.с.

Евгений Львович Насонов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

акад. РАН, научный руководитель ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой

Список литературы

Дополнительные файлы