CYP7A1 gene polymorphism and the characteristics of dyslipidemias in patients with nonalcoholic fatty liver disease concurrent with hypothyroidism

Full Text

ДП — доверительный предел ИА — индекс атерогенности ЛПВП — липопротеины высокой плотности ЛПНП — липопротеины низкой плотности ПЦР — полимеразная цепная реакция ТГ — триглицериды ХС — холестерин (холестерол) ЩЖ — щитовидная железа CYP7A1 — холестерол-7α-гидроксилаза Коррекция нарушений липидного обмена является приоритетным направлением в клинической практике врачей любой специальности. С одной стороны, это связано с широким распространением дислипидемий, а с другой — с увеличением метаболически обусловленных заболеваний и их фатальных осложнений [1]. Дислипидемии — это нарушение функции и/или состава липидов и липопротеинов крови, что может быть следствием многочисленных причин и способно самостоятельно или во взаимодействии с другими факторами риска обусловливать манифестацию атеросклеротического процесса [2]. В первую очередь необходимо учитывать повышение уровня общего холестерина (ХС), ХС липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов (ТГ). Дислипидемии могут быть следствием генетических нарушений (первичные) и/или сопутствующих заболеваний (вторичные) [2, 3]. Гипотиреоз — одна из наиболее распространенных форм тиреоидной дисфункции [4]. Это клинический синдром, который обусловлен стойким дефицитом тиреоидных гормонов в организме вследствие различных причинных факторов, проявляется нарушением обмена веществ, вызывая изменения всех органов и систем организма [5, 6]. Снижение тиреоидной функции при гипотиреозе, как правило, сопровождается нарушением липидного обмена — повышением уровня общего ХС, ХС липопротеинов очень низкой плотности, ХС ЛПНП, снижением уровня ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), главным образом ЛПВП-2, а также повышением концентрации апо-β/апо-α1 ТГ [7]. Одну из ключевых позиций в метаболизме стероидов занимает фермент суперсемейства цитохромов Р450 — холестерол-7α-гидроксилаза (CYP7A1). Фермент CYP7A1, являясь оксидоредуктазой, служит лимитирующим фактором в превращении холестерола (ХС) в 7α-гидроксихолестерол, тем самым либо увеличивая синтез ХС, либо уменьшая его за счет активации синтеза желчных кислот. При повышенном уровне ХС CYP7A1 активирует ядерный рецептор LXR (liver X-receptor), что приводит к усилению продукции желчных кислот и уменьшению синтеза ХС гепатоцитами. Ядерные рецепторы тиреоидных гормонов LXR и TR совместно контролируют метаболизм ХС в печени путем взаимодействия сигнальных путей с вовлечением транскрипционного фактора ChREBP (carbohydrate-response element-binding protein) [8]. Полиморфизм –204А>С (rs 3808607) в промоторной зоне гена CYP7A1 влияет на активность CYP7A1 [9], что может приводить к нарушению метаболизма ХС и желчных кислот и проявляется гиперхолестеринемией и триглицеридемией в условиях сниженной функции щитовидной железы (ЩЖ) [10]. Цель исследования — изучить связь полиморфных вариантов –204А > С (rs 3808607) гена CYP7A1 с развитием дислипидемий у практически здоровых лиц, у больных НАЖБП и при сочетании НАЖБП с гипотиреозом. Материалы и методы В исследование включили 180 пациентов, которых распределили на группы: 1-я (контрольная) — 60 практически здоровых человек без заболеваний ЩЖ и печени, но имеющих отклонения от нормы в показателях липидограммы; 2-я — 60 пациентов с впервые выявленным гипотиреозом (уровень тиреотропного гормона — ТТГ ≥10 мМЕ/мл) и с НАЖБП; 3-я — 60 пациентов с НАЖБП, которую диагностировали согласно «Рекомендациям по диагностике и лечению неалкогольной жировой болезни печени» (М., 2012) [11]. Группы сопоставимы по возрасту (средний возраст в 1-й группе 50,4 года со стандартным отклонением 8,5 года, во 2-й группе — 49,4 года со стандартным отклонением 9 лет, в 3-й группе — 50,2 года со стандартным отклонением 9 лет) и полу (в 1-й группе женщин 52%, во 2-й группе 52% и в 3-й группе 55%). Всем больным ферментативным методом определяли в сыворотке крови уровни общего ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПВП. Индекс атерогенности (ИА) рассчитывали по формуле: ИА = (общий ХС – ЛПВП)/ЛПВП. Обязательным было проведение ультразвукового исследования ЩЖ и органов брюшной полости с определением степени стеатоза печени: І степень — ткань печени диффузно уплотнена, сосудистый рисунок обеднен, размеры правой доли печени 15—17 см; ІІ степень — ткань печени диффузно уплотнена, сосудистый рисунок обеднен, размеры правой доли печени 17—19 см, появление эффекта дорсального затухания эхо-сигнала; ІІІ степень — ткань печени диффузно уплотнена, размеры правой доли печени больше 19 см, полный эффект дорсального затухания эхо-сигнала, при котором нижний край печени практически не визуализируется, выраженное обеднение сосудистого рисунка (печень как «сквозь молоко»). Для косвенной оценки степени выраженности морфологических изменений в печени проводили тест ФиброМакс, который рассчитывали с помощью апробированной в многоцентровых исследова-ниях запатентованной формулы с учетом коэффициента регрессии [12, 13]: f=4,467·log[α2-мак-роглобулин (в г/л)] – 1,357·log[гаптоглобин (в г/л) ]+1,017·log[γ-глутамил-транспептидаза (ед/л)]+0,0281· [возраст годы] +1,737·log[ билирубин (ммоль/л)] – 1,184·[аполипопротеин A1 (вг/л)] + 0,301·пол (ж=0, м=1) – 5,540 с использованием программного обеспечения (Materialise Ukraine). Тотальную ДНК выделяли из образцов крови по методике Chelex (Grimberg и соавт., 1989). Центрифугировали кровь на протяжении 2 мин в мини-центрифуге Bio-SanMicroSpin12 (Латвия) при 14 500 об/мин. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 200 мкл микропробирках в аплификаторе iCycler («BioRad», США). Для изучения полиморфизма rs 3808607 гена CYP7A1 использовали праймеры 5’-AATGTTTTTCCCAGTTCTCTTTC-3’ (прямой) и 5’-AATTAGCCATTTGTTCATTCTATTAG-3’ (обратный), описанные ранее [14]. Затем проводили рестрикцию продуктов ПЦР-амплификации размером 393 п.н., образованных при использовании пары праймеров с помощью рестриктазы Eco31I (BsaI), («Thermo Fisher Scientific», США) с учетом условий производителя. Распределение продуктов рестрикции ампликлонов, которые генерировались в ПЦР, проводили методом электрофореза в 3% агарозном геле в ТВЕ-буфере (0,089 М трис-НСl pH 8,0; 0,089 M борная кислота; 0,002 Mna3EDTA) при постоянном напряжении электрического поля 2,5 Вт/см и комнатной температуре на протяжении 2—3 ч в аппарате для горизонтального гель-электрофореза («Peqlab Biotechnologie GmbH», Германия). Агарозный гель красили в ТВЕ-буфере с 5 мкг/мл бромистого этидиума на протяжении 15 мин. После рестрикции получали 2 фрагмента размерами 93 и 300 п.н. для аллеля, А и 3 фрагмента размерами 39, 93 и 261 п.н. для аллеля С соответственно. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программного обеспечения Statistica 10. Использовали методику однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с определением среднего значения каждой выборки и доверительного предела (ДП) при коэффициенте надежности 95%, а также уровней статистической достоверности (р). Клинико-лабораторные и инструментальные исследования проводили на базе поликлинического отделения Сумской городской клинической больницы № 1 (Сумы, Украина), генетически-молекулярное исследование — в лаборатории ООО «Эласко-Арника» (Одесса, Украина). Результаты Во всех обследуемых группах наиболее часто встречался гомозиготный генотип АА (86,6% в 1-й группе, 80% во 2-й группе и 83,3% в 3-й группе), в меньшем процентном соотношении выявлен гомозиготный генотип СС (13,4, 20 и 16,7 соответственно), тогда как гетерозиготный генотип АС не выявлен ни у одного пациента. В 1-й (контрольной) группе при генотипе АА все показатели липидограммы находились в пределах нормы, тогда как при генотипе СС показатели липидограммы — в пределах нормы, но статистически достоверно (р<0,001) выше по сравнению с уровнем общего ХС, ЛПНП и уровнем ТГ у пациентов с генотипом АА (р<0,01); уровень ЛПВП достоверно меньше, чем при генотипе АА (р<0,001). Носители гомозиготного генотипа АА 2-й группы имели повышенный уровень общего ХС и ЛПНП, ТГ и сниженный уровень ЛПВП, тогда как у пациентов 3-й группы при таком же генотипе наблюдался достоверно более высокий уровень общего ХС и ЛПНП (р<0,001), при этом уровни ТГ и ЛПВП находились в пределах нормы и достоверно не отличались от таковых во 2-й группе. Носители гомозиготного генотипа СС 2-й группы имели повышенный уровень общего ХС, ТГ и сниженный уровень ЛПВП, тогда как уровень ЛПНП находился в пределах нормы. У пациентов 3-й группы при таком же генотипе наблюдался достоверно более высокий уровень общего ХС, ТГ и ЛПНП (р<0,001), а уровень ЛПВП был значительно снижен (р<0,05) (см. таблицу). Результаты анализа связи полиморфных вариантов rs 38088607 гена CYP7A1 с показателями липидного обмена у обследуемых групп Примечание.p — для различий между показателями при генотипах АА и СC. Обсуждение Несмотря на интенсивные исследования полиморфизма одиночных нуклеотидов гена CYP7A1 и их ассоциации с различными формами нарушений метаболизма ХС, в литературе еще не накоплено достаточного количества информации о характере распределения генотипов и соответственно степени их прогностического риска в различных этнических группах [9, 10, 14]. В отличие от данных, полученных Quang Cai и соавт. [8], свидетельствующих о преобладающем гетерозиготном варианте АС гена CYP7A1 в азиатской популяции, нами установлено, что в обследуемых группах превалировал гомозиготный вариант АА, который встречался более чем в 80% случаев. Анализ связи полиморфных вариантов rs 38088607 гена CYP7A1 с нарушением липидного обмена в обследуемых группах показал, что достоверно более высокие уровни атерогенных фракций ХС выявлены при генотипе СС по сравнению с носителями генотипа АА и не завесили от наличия НАЖБП и гипотиреоза. При этом в контрольной группе носительство генотипа СС обусловливало верхнеграничные уровни общего ХС, ЛПНП и ТГ и предельно низкие уровни ЛПВП со статистически значимым различием между генотипами. При сравнении атерогенных фракций липидограммы у пациентов 2-й группы с гипотиреозом и НАЖБП и 3-й группы с НАЖБП в каждом из генотипов выявлено достоверно более выраженное повышение уровня общего ХС и ТГ, при этом уровень ЛПНП находился в пределах нор-мы с достоверно более высокими значениями при генотипе АА по сравнению с генотипом СС в каждой из групп. Уровень ЛПВП был значительно снижен при генотипе СС в обеих группах по сравнению с генотипом АА без достоверных межгрупповых различий (р>0,05). Таким образом, развитие НАЖБП у носителей генотипа СС характеризуется наиболее выраженными изменениями липидного метаболизма (ИА 7,32 в 3-й группе) по сравнению с генотипами АА (ИА 4,56 во 2-й группе и 1,73 в 1-й группе) и СС (ИА 6,43 во 2-й группе и 2,52 в 1-й группе), что позволяет расценивать гомозиготный генотип АА как протекторный вариант мутации rs 38088607 гена CYP7A1. Тем не менее при функциональной недостаточности тиреоидных гормонов уровень ТГ даже при благополучном генотипе остается достоверно выше, чем при соответствующем варианте у пациентов 3-й группы с наличием только НАЖБП. Это свидетельствует о существенной роли гипотиреоза в развитии дислипидемии и НАЖБП и необходимости проведения заместительной гормональной терапии для эффективной коррекции липидного дисбаланса при гипотиреозе и НАЖБП. Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

About the authors

D A Zhaldak

O K Melekhovets

V F Orlovskyi

References

Supplementary files