Association of ITGB3, P2RY12, and CYP2C19 gene polymorphisms with platelet functional activity in patients with coronary heart disease during dual antiplatelet therapy

Full Text

АДФ — аденозиндифосфорная кислота АСК — ацетилсалициловая кислота ВОРТ — высокая остаточная реактивность тромбоцитов ДАТ — двухкомпонентная антиагрегантная терапия ИБС — ишемическая болезнь сердца Серьезной проблемой для больных ишемической болезнью сердца (ИБС) после эндоваскулярного вмешательства является предотвращение тромбозов стентированных коронарных артерий. С этой целью пациентам назначают двухкомпонентную антиагрегантную терапию (ДАТ), включающую клопидогрел и препараты ацетилсалициловой кислоты (АСК). Клопидогрел блокирует рецепторы P2Y12 и препятствует зависимой от аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) активации тромбоцитов, а АСК ингибирует циклооксигеназу-I тромбоцитов и эндотелиальных клеток, что приводит к подавлению образования мощного проагреганта тромбоксана А2. Разные пути влияния данных препаратов на активность тромбоцитов обеспечивают взаимное усиление их действия, эффективность комбинации показана в клинических исследованиях [1, 2]. Тем не менее у отдельных пациентов даже на фоне ДАТ сохраняется высокая агрегационная активность тромбоцитов, что обусловливает риск развития тромботических осложнений после эндоваскулярного вмешательства [3]. Среди причин высокой остаточной реактивности тромбоцитов (ВОРТ) или лабораторной резистентности к препаратам выделяют в том числе изменения структуры и активности рецепторов тромбоцитов и фермента цитохром P-450 2C19, обусловленные полиморфизмами генов, которые кодируют эти молекулы [4]. Поиск и изучение генетических маркеров, определяющих индивидуальную чувствительность пациентов к лекарственным препаратам, в перспективе позволит выделить группы наибольшего риска, прогнозировать вероятность тромботических осложнений и своевременно корректировать терапию у больных ИБС. В то же время для оценки значения внедрения генетического тестирования в клиническую практику важно учитывать этнотерриториальную специфичность в распространенности аллельных вариантов генов-кандидатов [5]. Целью исследования являлась оценка ассоциации полиморфизмов G681A гена CYP2C19, H1/H2 гена P2RY12 и T1565C гена ITGB3 со степенью агрегации тромбоцитов у больных ИБС на фоне приема клопидогрела и препаратов АСК среди жителей Западно-Сибирского региона. Материалы и методы В исследование включили 166 больных хронической ИБС мужского пола в возрасте 57 (52; 63) лет, жителей Западно-Сибирского региона, проходивших обследование в НИИ кардиологии (Томск) и направленных на стентирование коронарных артерий. Все респонденты дали информированное согласие на участие в исследовании. Диагноз заболевания устанавливали на основании общепринятых клинико-диагностических критериев. В рамках стандартной ДАТ пациенты получали препараты АСК и клопидогрел [6]. Функциональную активность тромбоцитов на фоне приема клопидогрела и АСК определяли с помощью теста индуцированной агрегации тромбоцитов методом оптической агрегометрии с использованием оригинальных реактивов на приборе AggRAM («Helena Laboratories», Великобритания). До проведения теста пациенты получали клопидогрел в суммарной дозе 300 мг и АСК в дозе 75—100 мг. В качестве индукторов агрегации использованы АДФ в концентрациях 2,5 и 5 мкМ и эпинефрин (адреналин) в концентрации 0,2 мкМ. За 0 агрегации принимали оптическую плотность обогащенной тромбоцитами плазмы, за 100% агрегации — бедной тромбоцитами плазмы. Степень агрегации, индуцированной АДФ, применяли для оценки эффективности клопидогрела в подавлении функциональной активности тромбоцитов, поскольку активный метаболит клопидогрела селективно ингибирует связывание АДФ с рецепторами P2Y12 тромбоцитов. Степень агрегации, индуцированной адреналином, использовали для оценки эффективности препаратов АСК. Адреналин, активируя тромбоцитарные фосфолипазы, приводит к высвобождению арахидоновой кислоты и образованию тромбоксана А2. Адреналин более специфичен для оценки индивидуальной чувствительности к препаратам АСК [7]. Степень агрегации тромбоцитов менее 45% на фоне ДАТ, как при стимуляции АДФ 5 мкМ, так и адреналином, принимали за норму, показывающую наличие эффекта антиагрегантных препаратов. В тех случаях, когда степень агрегации тромбоцитов как с АДФ 5 мкМ, так и с адреналином превышала 68%, диагностировали наличие ВОРТ, т. е. резистентность к клопидогрелу или препаратам АСК. В исследуемой выборке отмечены случаи сниженной реакции тромбоцитов на ДАТ, когда степень агрегации меньше 68%, но более 45%. Выделение ДНК из лейкоцитов проведено с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit («Promega», США). Генотипирование выполнено методом аллельспецифичной полимеразной цепной реакции («SNP-express», НПФ ЛИТЕХ, Россия) на амплификаторе T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США) с дальнейшей электрофоретической детекцией. Для статистического анализа данных использовали пакет SPSS v. 13. Соответствие распределения генотипов равновесию Харди—Вайнберга и частоту генотипов в разных группах проверяли с помощью критерия χ2 Пирсона и точного теста Фишера. Для сравнения степени агрегации использовали тест Крускала—Уоллиса и тест Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Результаты В нашей выборке генотипы GG, GA, AA полиморфизма G681A (rs4244285) гена CYP2C19 выявлены у 124 (74,7%), 39 (23,5%), 3 (1,8%) пациентов соответственно. Генотипы H1H1, H1H2, H2H2 полиморфизма H1/H2 гена P2RY12 обнаружены у 126 (75,9%), 38 (22,9%), 2 (1,2%) больных ИБС. Носителями генотипов TT, TC, CC полиморфизма T1565C (rs5918) гена ITGB3 явились 103 (62%), 60 (36,2%), 3 (1,8%) обследованных. Распределение частот генотипов генов CYP2C19, P2RY12, ITGB3 не отклонялось от равновесия Харди—Вайнберга (p=0,974; p=0,645; p=0,083 соответственно). В общей выборке больных ИБС степень агрегации с АДФ 2,5 (n=132) составила 33,7 (24,8; 42) %. Агрегация при стимуляции АДФ — 50 (n=151) была 47,3 (39,2; 55,6) %, а агрегация с адреналином (n=115) — 52,3 (41,3; 67,3) %. Случаи ВОРТ на фоне клопидогрела выявлены у 17 (10,2%) пациентов. Степень агрегации у них находилась в пределах 61,1 (57,0; 77,7) % при АДФ 2,5 и 79,5 (71,7; 81,9) % при АДФ 5,0. Сниженная реакция обнаружена у 45 (27,1%) больных ИБС, степень агрегации составила 43,5 (39,3; 46,8) % при АДФ 2,5 и 55,4 (52,5; 60,2) % при АДФ 5,0. ВОРТ на фоне приема препаратов АСК имелась у 27 (22,1%) пациентов, а агрегация в ответ на адреналин — 77,3 (72,6; 83,3) %. Сниженная реакция на АСК отмечена у 34 (27,9%) лиц. Степень агрегации у них составила 60,7 (53,6; 65,9) %. Проведены сопоставления частот генотипов в группах пациентов с ВОРТ, сниженной и нормальной реакцией на прием антиагрегантов, а также сравнительный анализ степени агрегации тромбоцитов между носителями разных генотипов. В группе пациентов, у которых выявлена ВОРТ на фоне клопидогрела, носителями генотипа GG гена CYP2C19 являлись 11 (64,7%), генотип GA отмечен у 6 (35,3%) больных ИБС. При этом среди лиц с резистентностью к клопидогрелу не было носителей генотипа AA. Частота аллеля 681A в данной группе составила 18%. В группе со сниженной реакцией на клопидогрел генотипы GG, GA, AA встречались соответственно с частотами 32 (71,1%), 12 (26,7%), 1 (2,2%). Частота аллеля 681A составила 16%. Распределение частот генотипов гена CYP2C19 в группах пациентов с ВОРТ, сниженной и нормальной реакцией на клопидогрел оказалось сопоставимым (p=0,655). Однако у носителей аллеля 681A гена CYP2C19 отмечен наибольший показатель агрегации при стимуляции АДФ в обеих концентрациях (табл. 1), что свидетельствует о меньшей степени подавления клопидогрелом активности тромбоцитов при носительстве данного аллеля. Таблица 1. Степень агрегации тромбоцитов у больных ИБС в зависимости от индуктора и полиморфных вариантов гена CYP2C19, % Примечание. p— для различий между носителями генотипов GG, GA, AA (тест Крускала—Уоллиса); p1 — для различий между GG и GA+AA (тест Манна—Уитни). Проведен сравнительный анализ частоты разных аллельных вариантов гена CYP2C19 между группами пациентов с ВОРТ, сниженной и нормальной реакцией на препараты АСК. Результаты показали отсутствие различий (p=0,128). При этом частоты генотипов GG, GA, AA в группе с ВОРТ составили 16 (59,3%), 9 (33,3%), 2 (7,4%), а в группе со сниженной реакцией — 26 (76,5%), 7 (20,6%), 1 (2,9%) соответственно. Агрегация на эпинефрин у носителей разных генотипов гена CYP2C19 также была сопоставимой (см. табл. 1). В группах больных ИБС с разной чувствительностью к антиагрегантам проведен анализ распространенности генотипов гена P2RY12. Частоты генотипов H1H1, H1H2, H2H2 в группе с ВОРТ на фоне клопидогрела составили 13 (76,5%), 3 (17,6%), 1 (5,9%). Сниженная реакция на клопидогрел обнаружена у 32 (71,1%) гомозигот H1H1 и 13 (28,9%) гетерозигот H1H2. Реакция на АСК отсутствовала у 23 (85,2%) гомозигот H1H1 и 4 (14,8%) гетерозигот, а сниженная реакция определена у 24 (70,6%) носителей H1H1 и у 10 (29,4%) носителей H1H2. Между рассматриваемыми группами отсутствовали достоверные различия по распределению генотипов (p=0,358 и p=0,414). Кроме того, носители разных полиморфных вариантов оказались сопоставимы по степени агрегации в ответ на АДФ и адреналин (табл. 2). Таблица 2. Степень агрегации тромбоцитов у больных ИБС в зависимости от индуктора и полиморфных вариантов гена P2RY12, % Примечание.p—для различий между группами H1H1 и H1H2 +H2H2 (тест Манна—Уитни). Не выявлено статистически значимой ассоциации между реакцией на клопидогрел и АСК и полиморфизмом T1565C гена ITGB3 (p=0,974 и p=0,467). В группе с ВОРТ на фоне клопидогрела 11 (64,7%) и 6 (35,3%) пациентов являлись носителями генотипов TT и TC, в группе со сниженной реакцией генотипы TT, TC, CC встречались с частотами 29 (64,4%), 15 (33,3%), 1 (2,2%). Частоты вариантов TT, TC, CC в выборке лиц, у которых отсутствовал ответ на АСК, составили 18 (66,7%), 8 (29,6%) и 1 (3,7%), а в выборке со сниженной эффективностью АСК — 20 (58,8%) и 14 (41,2%) (гомозиготы CC отсутствовали) и в выборке с нормальным ответом — 39 (63,9%) и 22 (36,1%) (гомозиготы CC отсутствовали). Степень агрегации при стимуляции АДФ и адреналином у носителей разных генотипов представлена в табл. 3. Таблица 3. Степень агрегации тромбоцитов у больных ИБС в зависимости от индуктора и полиморфных вариантов гена ITGB3, % Примечание. p — для различий между группами носителей генотипов TT, TC, CC (тест Крускала—Уоллиса); p1 — для различий между группами TT и TC+CC (тест Манна—Уитни). Обсуждение Согласно данным литературы полиморфизм H1/H2 гена P2RY12 и полиморфизм T1565C гена ITGB3 связаны с более высокой агрегационной активностью тромбоцитов [8—11], а носительство этих вариантов рассматривается как фактор риска сниженной эффективности антиагрегантов в предотвращении сердечно-сосудистых осложнений. Однако анализ результатов, полученных в нашей выборке, не выявил статистически значимых различий по степени агрегации на фоне приема клопидогрела и АСК у носителей разных генотипов как гена P2RY12, так и гена ITGB3. Более того, одинаковым оказалось и распределение частот генотипов в группах пациентов с разной реакцией на антиагреганты, что подтверждают полученные нами ранее данные [12]. Эти результаты хорошо согласуются с выводами других исследователей, показавших отсутствие статистически значимой ассоциации генов P2RY12 и ITGB3 с ответом на антиагреганты [13, 14]. Это позволяет сделать вывод, что полиморфизмы H1/H2 гена P2RY12 и T1565C гена ITGB3 не вносят вклад (или он незначительный) в формирование резистентности к клопидогрелу и АСК у больных ИБС, жителей Западно-Сибирского региона. Известно, что в образование активного метаболита клопидогрела, ингибирующего связывание АДФ с рецепторами P2Y12 и тем самым угнетающего агрегацию тромбоцитов, вовлечен белок CYP2C19. Замена G681A в гене CYP2C19 определяет изменение рамки считывания мРНК и синтез белка с низкой метаболической активностью [15], что обусловливает риск ВОРТ на фоне клопидогрела и увеличение вероятности развития тромбозов стентов [16]. Известно, что в разных этнических группах частота аллельных вариантов гена CYP2C19 варьирует. В нашей выборке больных ИБС, проживающих на территории Западно-Сибирского региона, частота аллеля 681A составила 14%, что соответствует данным, полученным для других европейских популяций [17]. Среди пациентов с ВОРТ и сниженной реакцией на клопидогрел частота аллеля 681A составила 16%, что также соответствует результатам, полученным для пациентов с ИБС в других европейских выборках [15, 16]. В рассматриваемой выборке мы получили статистически значимую ассоциацию носительства аллеля 681A полиморфизма G681A гена CYP2C19 с повышенной степенью агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ. Есть все основания полагать, что выявление полиморфизма G681A гена CYP2C19 перед плановым эндоваскулярным вмешательством в клинической практике поможет прогнозировать эффективность антиагрегантной терапии и своевременно ее корректировать. Заключение В выборке больных ИБС, постоянно проживающих на территории Западно-Сибирского региона, отсутствовала сопряженность полиморфизмов H1/H2 гена P2RY12 и T1565C гена ITGB3 со степенью индуцированной агрегации тромбоцитов и частотой ВОРТ на фоне приема клопидогрела и АСК. Однако выявлена ассоциация между носительством аллеля 681A полиморфизма G681A гена CYP2C19 и повышенной степенью агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, на фоне терапии клопидогрелом и АСК, что является фактором риска развития тромботических осложнений после стентирования коронарных артерий. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

About the authors

E F Muslimova

S A Afanasiev

T Yu Rebrova

T N Sergienko

A N Repin

References

Supplementary files