COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA: COMPARISON OF ETIOLOGICAL DIAGNOSTIC METHODS IN CLINICAL PRACTICE

Full Text

АБ — антибиотики АБТ — антибактериальная терапия АГ — антигены АТ — антитела ВП — внебольничная пневмония ИФА — иммуноферментный анализ КОЕ — колониеобразующие единицы МБИ — микробиологическое исследование ПЦРИ — исследование с проведением ПЦР ЭД — этиологическая диагностика Внебольничные пневмонии (ВП) в экономически развитых странах относятся к числу наиболее распространенных острых инфекционных заболеваний. Так, в США ежегодно регистрируется 5,6 млн больных ВП, из которых 1,7 млн госпитализируют [1]. В России, по данным Центрального научно-исследовательского института организации и информатизации здравоохранения Росздрава, в 2006 г. было зарегистрировано 591 493 случая ВП. Однако эти цифры не отражают реальную заболеваемость, которая по расчетам составляет более 1,5 млн случаев ВП в год. Таким образом, большинство пациентов с ВП остаются неучтенными [2, 3]. По данным National Center for Health Statistics, в возрастной группе старше 60 лет более чем в 10 раз увеличивается частота госпитализаций и летальность больСведения об авторах: Пустовалов Алексей Алексеевич — соискатель каф. факультетской терапии и профессиональных болезней МГМСУ; Чучалин Александр Григорьевич — д-р мед. наук, проф., акад. РАМН, дир. НИИ пульмонологии ФМБА России; Хаптхаева Галина Эр-дниевна — аспирант НИИ пульмонологии ФМБА России; Ткачев Герман Александрович — канд. мед. наук, мл. науч. сотр. лаб. пульмонологии отд. клинической медицины НИМСИ МГМСУ; Зыков К. А. — д-р мед. наук. зав. лаб. пульмонологии отд. клинической медицины НИМСИ МГМСУ; Соколов Евгений Иванович — д-р мед. наук, проф., акад. РАМН, зав. каф. факультетской терапии МГМСУ. ных по сравнению с летальностью в предшествующих возрастных группах [4, 5]. У лиц молодого и среднего возраста заболеваемость составляет до 11,6%о, а у лиц старших возрастных групп — до 44%о [2, 5]. В экономически развитых странах ВП занимает 4—6-е место среди всех причин смерти и 1-е место среди причин смерти от инфекционных заболеваний. Так, согласно данным Минздравсоц-развития России, в 2006 г. в стране от пневмонии умерли 38 970 человек, что составляет 27,3 случая на 100 000 населения [2]. Ключевым элементом лечения ВП является антибактериальная терапия (АБТ). Она должна быть ранней и адекватной. Как правило, на начальном этапе пациенты получают эмпирическую терапию антибиотиками (АБ) широкого спектра действия, а затем в идеале они в зависимости от этиологического фактора должны быть заменены на АБ узкого спектра. Для этого необходимо своевременное установление этиологического диагноза. Поздняя этиологическая диагностика (ЭД) и как следствие назначение неадекватной терапии приводят к утяжелению состояКонтактная информация: Рвачева Анна Валерьевна — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. пульмонологии отд. клинической медицины НИМСИ МГМСУ, e-mail: arvatcheva@mail.ru — 12 — Этиологические методы диагностики внебольничной пневмонии ния пациентов, развитию осложнений и повышению смертности [6]. Для установления этиологии пневмонии в настоящее время используют сначала бактериоскопиче-ское исследование (мокрота, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, кровь) — на первом этапе проводят окраску мазков по Граму, что позволяет провести предварительную идентификацию возбудителей с определением грамположительных и грамотрица-тельных кокков и палочек [7]. На втором этапе проводят культуральное исследование — посев мокроты и крови. В настоящее время микробиологическое исследование (МБИ) рекомендуют проводить у всех госпитализированных пациентов, при неудачной предшествующей АБТ по поводу данного заболевания, при наличии деструктивных процессов в легочной ткани, плеврального выпота [8]. Серологическую диагностику используют для выявления уровня антител (АТ) к возбудителям ВП, наиболее часто — при подозрении на ВП, вызванную атипичными возбудителями: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae и Legionella spp. [9, 10]. Для определения содержания антигенов (АГ) в моче чаще всего применяют радиоиммунологический и иммуноферментный методы для выявления АГ L. pneumophila (серогруппа I) и иммунохроматографический для определения АГ S. pneumoniae [11—13]. Молекулярно-генетическая диагностика является новым методом, наибольшее распространение получил метод с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако, несмотря на наличие большого количества различных методов лабораторной диагностики, этиологический диагноз ВП не удается установить в 50—70% случаев [14] и, как следствие, основным подходом к лечению ВП является эмпирический выбор антибактериальных препаратов и, как правило, это АБ широкого спектра действия. Таким образом, основной задачей для специалистов является выбор наиболее рациональных методов исследования для установления этиологии ВП, что позволит оптимизировать лечение, в частности назначать АБ узкого спектра действия с учетом этиологического фактора. Целью настоящего исследования было проведение сравнительной оценки различных методов ЭД ВП. Материалы и методы В исследование включили 20 мужчин и 10 женщин в возрасте 21—75 лет (средний возраст 50,5 ± 3,4 года), больных ВП нетяжелого течения, находившихся на лечении в ГУ НИИ пульмонологии Минздравсоцразвития России. У всех диагноз пневмонии был подтвержден рентгенологически (наличие свежей очаговой инфильтрации). Критериями включения были: • наличие у пациента диагноза ВП нетяжелого течения (2-й и 3-й групп) в соответствии с "Практическими рекомендациями по диагностике, лечению и профилактике внебольничной пневмонии у взрослых, 2003"; • рентгенологическое подтверждение наличия очаговой инфильтрации; • наличие не менее двух из перечисленных признаков: острая лихорадка (температура тела > 38oC), кашель с мокротой, физические признаки, лейкоцитоз (> 10 • 109/л) или палочкоядерный сдвиг (> 10%); • возраст от 20 до 80 лет включительно. Критериями исключения из исследования были: • отказ больного от включения в исследование; • включение больного в другое исследование; • любые иные пневмонии, помимо ВП, острые и хронические (в стадии обострения) заболевания воспалительного характера; • прием АБ до поступления в стационар; • онкологические заболевания; • туберкулез в анамнезе; • другие сопутствующие заболевания или состояния, которые, по мнению исследователей, могли нарушить ход исследования. Для проведения МБИ использовали индуцированную мокроту. Ее отбирали в стерильный одноразовый контейнер, который доставляли в микробиологическую лабораторию в течение 1 ч. Вначале проводили визуальную оценку мокроты, из порции, имевшей наибольшую "гнойность", готовили мазок, высушивали его, фиксировали и окрашивали по Граму. Анализ проводили на световом микроскопе Leica DMLS (ФРГ) под малым увеличением. В мазке подсчитывали количество эпителиальных клеток и лейкоцитов. Образцы мокроты, удовлетворяющие критериям Murrey—Wash-ington — менее 10 эпителиальных клеток и более 25 лейкоцитов в поле зрения (• 100) — исследовали на культуры. Образцы, не соответствующие данным требованиям, свидетельствовали о контаминации полости рта; их исключали из исследования. Материал высевали на твердые питательные среды (кровяной агар, Эндо, шоколадный агар, среда Сабуро) и культивировали в течение 18— 24 ч при 36—37oC. Диагностически значимой считали концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ) > 106/мл для мокроты (> 105/мл при выделении Streptococcus pneumoniae). В полученном материале оценивали только потенциально патогенные бактерии. К потенциально непатогенным бактериям относили Streptococcus viridians, Neisseria spp., Corynebacterium spp., Candida spp., Entero-coccus spp., коагулазонегативные стафилокки. Молекулярно-генетическое исследование индуцированной мокроты и периферической крови проводили методом ПЦР (ПЦРИ) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. Ее осуществляли на амплификаторе "Терцик" с использованием комплектов семейства АмплиСенс (ООО "ДНК-технология"). Для детекции продуктов амплификации использовали камеры SE-2 ("Хеликон") и источник питания "Эльф-4" ("ДНК-Технология"). Полученное изображение геля фиксировали на компьютере с помощью видеосистемы для регистрации гелей ViTran. Программное обеспечение регистрации: ViTran, Biotest-D производства ООО "Биоком". Серологическое исследование включало определение уровня АТ класса IgM и IgG к Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae в сыворотке крови и проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем компании "Savyon Diagnostics" (Израиль) по стандартной методике. Измерение результатов проводили на микропланшетном ридере Anthos-2020 (Австрия) при длине волны 450 нм. Результаты и обсуждение Патогенная флора была выявлена у 23 (76,7%) пациентов, и лишь у 7 (23,3%) пациентов она не определялась. Среди возбудителей преобладал Streptococcus pneumoniae, который был выявлен у 14 (53,3%) пациентов. У 8 (26,7%) пациентов был обнаружен Haemophilus influenzae, у 7 (23,1%) — Mycoplasma pneumoniae, у 6 (20%) — Klebsiella pneumoniae, у 6 (20%) — Adenovirus и у 4 (13,2%) — Chlamydophila pneumoniae. Метод ПЦР выявил возбудителей (вирусно-бактериальные миксты) в крови лишь у 2 (6,7%) пациентов. Данные, полученные при проведении ПЦРИ и МБИ мокроты, были сопоставимы. Возбудитель был выявлен у 19 пациентов. Однако при проведении — 13 — А. А. Пустовалов и соавт. Сравнение результатов ПЦРИ и МБИ Возбудитель ПЦРИ крови ПЦРИ мокроты МБИ Mycoplasma pneumoniae 0 2 (6,7) — Streptococcus pneumoniae 1 (3,3) 14 (46,6) 14 (46,6) Klebsiella pneumoniae 2(6,7) 4 (13,3) 2 (6,7) Haemophilus influenzae 0 8 (26,7) 3 (10,0) Adenovirus 2 (6,7) 4 (13,3) — Примечание. Данные представлены как число больных (в скобках — процент). анализа выявленных возбудителей были отмечены существенные различия между данными, полученными двумя методами. Из 19 (63,3%) пациентов, у которых возбудитель был определен при ПЦРИ мокроты, 10 (33,3%) имели монобактериальную флору, 5 (16,7%) — бактериальные миксты и 4 (13,3%) — вирусно-бактериальные миксты, в то время как при МБИ у всех 19 пациентов выявлена только монобак-териальная флора. При сравнительном анализе различных методов ЭД ВП с оценкой общего количества положительных результатов, полученных при том или ином методе исследования, наименьшее количество положительных результатов было получено при ПЦРИ крови — всего лишь 5, в то время как при ПЦРИ мокроты — 30, а при МБИ мокроты — 19. Различия были не только в общем количестве положительных результатов, но и в частоте выявления тех или иных возбудителей. Частота выявления Streptococcus pneumoniae была сопоставимой как при ПЦРИ, так и при МБИ, а частота выявления Klebsiella pneumoniae и Haemophilus influenzae была выше при исследовании мокроты методом ПЦР (см. таблицу). Для определения сопоставимости данных, полученных молекулярно-генетическим и микробиологическим методами, было проведено сравнение пациентов, у которых был получен положительный результат по каждому из определяемых возбудителей. Из 14 пациентов, у которых в крови был выявлен Streptococcus pneumoniae при ПЦРИ, у 2 данные не совпадали с данными МБИ, и та же картина наблюдалась при МБИ. Из 6 пациентов, у которых Klebsiella pneumoniae была выявлена методом ПЦРИ, у 4 она не была определена МБИ, а при диагностике Haemophilus influenzae несоответствие между данными двух методов было наиболее значительным. Так, из 8 положительных результатов, полученных методом ПЦР, 6 не были выявлены при МБИ, в то время как всего лишь 1 из 3 выявленных при МБИ не был определен при ПЦРИ. Для выявления атипичных возбудителей, таких как Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae, определяли уровень АТ класса IgM и IgG к данным возбудителям методом ИФА, который позволяет проводить диагностику в короткие сроки в отличие от МБИ, которая в данном случае представляет собой чрезвычайно трудоемкий и длительный процесс, так как атипичные микроорганизмы растут крайне медленно и требуют специальных сред. При проведении ИФА сыворотки крови АТ класса IgM к Mycoplasma pneumoniae, свидетельствующие об остроте процесса, были выявлены у 6 (20%) пациентов, а класса IgG — у 10 (33,3%) пациентов, в то время как при ПЦРИ мокроты возбудитель был обнаружен лишь у 2 (6,7%) пациентов. В свою очередь АТ класса IgM к Chlamydophila pneumoniae были выявлены у 4 (13,3%) пациентов, а класса IgG — у 21 (70%) пациента, сам же возбудитель обнаружен не был. О бсужде ние В настоящее время классификация пневмонии основана на этиологическом принципе, что важно для оценки тяжести течения заболевания и определения стратегии лечения. Однако, несмотря на наличие большого количества методов лабораторной диагностики, этиологический диагноз ВП не удается установить в 50—70% случаев, что нередко приводит к назначению неадекватной терапии и как следствие к утяжелению состояния пациента, развитию осложнений и повышению смертности. В настоящее время основной задачей для специалистов является выбор наиболее рациональных методов исследования для установления этиологии ВП, что позволяет оптимизировать лечение, в частности назначать АБ узкого спектра действия с учетом этиологического фактора. Своевременное назначение адекватной терапии позволит уменьшить количество и продолжительность госпитализаций, снизить летальность и риск развития резистентности, а также уменьшить экономические потери. Известно, что результативность и достоверность ЭД во многом зависят от характера исследуемого материала, применяемых методов и их комбинаций, правильной трактовки полученных результатов [15]. Если рассматривать плюсы и минусы различных современных методов диагностики ВП, то окраска мазков по Граму является неинвазивным методом, не представляет риска для пациента, может быть проведена в короткие сроки и с минимальными экономическими затратами. Однако есть данные, что она обладает низкой чувствительностью и специфичностью [7]. Для некоторых возбудителей существуют методы, позволяющие проводить быструю диагностику у постели больного. ATS (American Thoracic Society) и IDSA (The Infectious Diseases Society of America) рекомендуют использовать в качестве скринингового метода определение АГ L. pneumophila и S. pneumoniae в моче, учитывая быстроту и простоту его проведения [6, 8]. Этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью: для L. pneumophila чувствительность составляет от 70 до 90% и специфичность около 99% [11], а для S. pneumoniae — 50—80 и 90% соответственно [16, 17]. Однако в нашей стране данные методы диагностики не получили широкого распространения. Теперь "золотым стандартом" диагностики ВП считается МБИ. Однако для атипичных возбудителей респираторной патологии эта диагностика представляет собой чрезвычайно трудоемкий и длительный процесс, так как микроорганизмы растут крайне медленно и требуют специальных сред, в связи с этим данный метод применяют в основном в исследовательских целях [18, 19]. Поэтому наиболее при — 14 — Этиологические методы диагностики внебольничной пневмонии емлемым стандартом диагностики микоплазменной и хламидийной инфекции сегодня является серологическая диагностика с обнаружением специфических IgM и IgG [9, 10, 18]. С этой целью используют ИФА, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (92 и 95% соответственно). Он также позволяет проводить диагностику в короткие сроки [18, 19]. Было показано, что определение IgM, как маркера острой инфекции, имеет высокую диагностическую чувствительность для раннего выявления инфицирования Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae [19, 20]. Полученные нами данные также подтверждают диагностическую значимость выявления АТ к атипичным возбудителям. АТ класса IgM к Mycoplasma pneumoniae были выявлены у 20% пациентов (это коррелирует с данными французских исследователей [20]), к Chlamydophila pneumoniae — у 13,3% пациентов. Как известно, IgM высокоспецифичен и появляется в острой фазе инфекционного процесса. Но далеко не у всех пациентов, у которых есть атипичные возбудители, он определяется, так как чувствительность ограничена периодом времени, прошедшим от начала заболевания. АТ класса IgM появляются через 4 дня от момента инфицирования, достигая максимума к 7-му дню, а период их полураспада составляет 5 сут. Затем происходит сероконверсия, и через неделю начинают синтезироваться низкоавидные (обладающие низкой способностью к связыванию антигена) IgG. С течением времени происходит повышение авидности АТ и их уровня. Максимальные уровни IgG наблюдаются, как правило, через 4 нед от начала заболевания, а период полураспада IgG составляет 21 день. АТ класса IgG к Mycoplasma pneumoniae и Chla-mydophila pneumoniae были выявлены нами у 33,3 и 70% пациентов соответственно. Преобладание IgG у них может свидетельствовать о наличии хронического процесса, носительстве или о том, что от начала заболевания прошел определенный период времени. Диагностическое значение имеет нарастание титров IgG в парных сыворотках. Однако диагностика этого процесса требует не меньше времени, чем МБИ, так как интервал между взятием проб составляет 7—14 дней [19, 20] и установление диагноза происходит постфактум. Таким образом, диагностика атипичных инфекций по изменению титров IgG может быть использована для эпидемиологических исследований, но не в обычной клинической практике для диагностики такого острого процесса, которым является ВП. Необходимо также отметить, что при проведении диагностики с помощью ПЦР в мокроте Mycoplasma pneumoniae была выявлена у 6,7% пациентов, а Clamydophila pneumoniae не обнаружена ни у одного. Таким образом, серологическая диагностика с определением уровня АТ класса IgM к Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae является высокочувствительным методом ЭД ВП и может использоваться для раннего выявления этих патогенов. Одним из основных преимуществ МБИ является возможность определения чувствительности выявленных возбудителей к АБ. Однако достоверность полученных данных зависит от ряда факторов: правиль ности взятия материала (нередко наблюдается контаминация микрофлорой верхних дыхательных путей и полости рта), условий транспортировки, применения АБТ до взятия пробы, наличия некультивируемых форм микроорганизмов [7, 15]. Даже при наличии адекватных проб мокроты у 20—45% пациентов не удается выделить возбудителя [21], а культуральное исследование крови дает положительный результат лишь в 5—10% случаев [22, 23]. Существенным недостатком данного метода также является длительность его проведения. От момента взятия материала до получения результатов МБИ проходит несколько дней, а, как известно, эффективность АБТ оценивают через 48—72 ч, следовательно, при неэффективности стартовой терапии смена АБ чаще всего происходит до того, как будут получены результаты МБИ. В работах, проведенных в разных странах, показано, что получить пробы мокроты представляется возможным лишь у 34—40% пациентов, при этом пригодными для исследования оказываются 40— 94% полученных проб, возбудитель был выявлен в 34—70% случаев [24—25]. Нами при проведении МБИ возбудитель был выявлен у 63,3% пациентов. Однако необходимо отметить, что эти данные не отражают полную этиологическую картину, так как у всех пациентов была выявлена лишь монобактери-альная флора, в то время как при применении других методов исследования (ИФА, ПЦРИ) было показано, что у пациентов наблюдаются также бактериальные и вирусно-бактериальные миксты. Также в зависимости от используемого метода исследования различался и спектр выявляемых возбудителей. При МБИ наиболее часто выявлялся Streptococcus pneumoniae (46,6%), так же как с помощью ПЦР (см. таблицу). При этом необходимо отметить, что сопоставимо было не только количество положительных результатов, но и число пациентов, у которых данный возбудитель определялся. Если говорить о таких возбудителях, как Klebsiella pneumoniae и Haemophilus influenzae, то при МБИ они были выявлены у 6,7 и 10% больных соответственно, а при ПЦРИ — у 13,3 и 26,7% соответственно. Поэтому мы можем считать, что МБИ — высокоспецифичный метод диагностики при ВП, вызванной Streptococcus pneumoniae, и не уступает по своей эффективности ПЦРИ. При ВП, вызванной Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, атипичными возбудителями и вирусами, необходимо использовать другие методы. Так как при МБИ не удается выявить возбудителя в 45% случаев, то в настоящее время отмечается тенденция к более широкому применению молекулярно-генетических методов исследования, в частности real-time ("моментальной") ПЦР. Использование этой методики требует наличия специально оборудованной ПЦР-лаборатории (отдельные помещения, специальное оборудование, подготовленный персонал) и строгое соблюдение правил взятия и транспортировки биоматериала с целью предотвращения контаминации. Тем не менее преимуществами данного метода являются точность и быстрота диагностики [14, 26—28]. "Моментальная" ПЦР позволяет не только быстро (в течение 15 А. А. Пустовалов и соавт. нескольких часов) выявить количество копий возбудителя и его генетический тип, но и определить генетические основы устойчивости патогена к АБ за счет выявления нуклеарных факторов, ответственных за чувствительность к АБ. Наиболее перспективным является мультиплексная ПЦР в режиме реального времени, позволяющая проводить количественную оценку различных возбудителей в одной пробе. Однако не следует отказываться и от МБИ, так как в настоящее время не все нуклеарные факторы устойчивости к АБ известны. Учитывая данные, полученные в нашем исследовании, можно говорить о том, что ПЦР-диагностика имеет ряд преимуществ перед МБИ. Так, если общие проценты пациентов, у которых был выявлен возбудитель при ПЦРИ и МБИ, были сопоставимы, то количество положительных результатов и спектр выявляемых возбудителей существенно различались. При МБИ было получено суммарно 19 положительных результатов, а при ПЦРИ — 30. Для ответа на вопрос о том, что является причиной данных различий — гипердиагностика методом ПЦР или недостаточная чувствительность МБИ, необходимы дополнительные исследования. Это и позволит ответить на вопрос, что же в ближайшем будущем будет "золотым стандартом" в диагностике этиологии ВП. Можно сказать, что ПЦР-диагностика — высокоспецифичный метод ЭД ВП, не уступающий по эффективности МБИ. Поэтому молекулярно-генетическое исследование может быть использовано для ранней и комплексной ЭД ВП в тех учреждениях, где есть лаборатории ПЦР, соответствующие всем требованиям. При подозрении на ВП, вызванную атипичными возбудителями, такими как Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae, наиболее приемлемым методом ЭД является серологическое исследование с определением уровня специфических IgM к данным возбудителям. Заключе ние В современных условиях целесообразна комбинация различных методов ЭД ВП: выявление АГ S. pneumoniae и L. pneumophila в моче у постели больного; микробиологических — для определения бактериальных патогенов, за исключением атипичных возбудителей, а также определения чувствительности к АБ; молекулярно-генетических как для бактериальных, так и для вирусных возбудителей, в том числе у пациентов с нетяжелой пневмонией, и серологических для выявления атипичных возбудителей.

About the authors

A A Pustovalov

Moscow State Medical Stomatological University

A V Rvacheva

Moscow State Medical Stomatological University

Email: arvatcheva@mail.ru

A G Chuchalin

Research Institute of Pulmonology

E I Sokolov

Moscow State Medical Stomatological University

G E Khaptkhaeva

Research Institute of Pulmonology

G A Tkachev

Moscow State Medical Stomatological University

K A Zykov

Moscow State Medical Stomatological University

References

Supplementary files