Proinflammatory laboratory predictors of pneumonia in ischemic stroke patients: prospective study

Full Text

Список сокращений

ДИ – доверительный интервал

ИИ – ишемический инсульт

ИЛ – интерлейкин

НЭ – нейтрофильная эластаза

ОШ – отношение шансов

ПЦОР – прогностическая ценность отрицательного результата

ПЦПР – прогностическая ценность положительного результата

СРБ – С-реактивный белок

ФНО-a – фактор некроза опухоли a

NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) – шкала инсульта Национального института здоровья

SAA (serum amyloid A) – сывороточный амилоид A

sPLA2 (secreted phospholipase A₂) – секреторная фосфолипаза А₂

Обоснование

В настоящее время ведутся исследовательские работы по поиску биомаркеров во всех направлениях медицины, в том числе в области цереброваскулярной патологии. В силу своих эпидемиологических характеристик ишемический инсульт (ИИ), несомненно, представляется важным объектом, поскольку помимо высокой летальности сопровождается значительной частотой осложнений и инвалидизации, которые в итоге оборачиваются существенными экономическими затратами [1]. Поиск лабораторных биомаркеров, с помощью которых возможно прогнозирование развития осложнений инсульта, остается актуальной задачей, поскольку позволяет индивидуализировать подход к лечению и реабилитации пациентов.

Бактериальная пневмония – одно из наиболее частых осложнений ИИ на госпитальном этапе. По данным разных авторов, она развивается у 26–62% пациентов с ИИ [2, 3]. Основной причиной развития пневмонии служат нарушения глотания и аспирация, также среди причин выделяют парез дыхательных мышц, подавленный кашлевой рефлекс, гиподинамию [4]. Раннее прогнозирование развития пневмонии позволит персонализировать тактику ведения пациента и снизить частоту наступления неблагоприятных исходов. Возможными прогностическими биомаркерами могут стать белки острой фазы воспаления, для части из которых была продемонстрирована значимость при ИИ. Так, С-реактивный белок (СРБ) обладает значимостью в прогнозе исхода инсульта [5–7], служит предиктором неблагоприятного функционального исхода [8], а повышение его концентрации >7 мг/л взаимосвязано с тяжелым состоянием по NIHSS (шкала инсульта Национального института здоровья – National Institutes of Health Stroke Scale) [9]. Интересным представляется тот факт, что исключение из выборки пациентов с инфекционными осложнениями ИИ не влияет на установленную взаимосвязь СРБ с плохим функциональным исходом [10].

Содержание такого белка острой фазы, как фактор некроза опухоли α (ФНО-α), повышается при ИИ и в высоких концентрациях вызывает расстройства гемодинамики, а также оказывает цитотоксический эффект, что может осложнить течение заболевания [11, 12].

Кроме того, в многочисленных исследованиях была установлена связь повышения концентрации провоспалительного цитокина интерлейкина (ИЛ)-6 с течением инсульта. Концентрация ИЛ-6 коррелировала с объемом очага поражения, риском развития инфекционных осложнений и наступления летального исхода [13, 14].

Еще один маркер воспаления и активации иммунной системы – белок неоптерин, повышение концентрации которого сопряжено с развитием системного воспалительного ответа [15]. Показано, что содержание неоптерина статистически значимо повышается у больных с ИИ и может быть использовано в качестве независимого прогностического маркера функционального исхода и смерти [16].

Локализованная в гранулах нейтрофилов гранулоцитарная (или нейтрофильная) эластаза (НЭ), являющаяся по своей функции протеиназой, при фагоцитозе частично секретируется в окружающее пространство, а при выраженном воспалении может локально повреждать ткани. Установлено, что активность НЭ повышается при инсульте, а особенно – после тромболитической терапии, вследствие чего пациенты после тромболизиса могут подвергаться более высокому риску развития инфекционных осложнений [17].

Сывороточный амилоид А (serum amyloid A – SAA) – еще один ранний медиатор воспаления, содержание которого повышается во время острой фазы в 100–1000 раз. Наряду с провоспалительной активностью SAA оказывает и противовоспалительное действие: ингибирует ФНО-α, ИЛ-1, лимфоциты, агрегацию тромбоцитов. Уровень SAA повышен у пациентов с ИИ [18] и служит предиктором у них инфекционных осложнений [19].

В тучных клетках, фибробластах, макрофагах содержится фермент секреторная фосфолипаза А₂ (secreted phospholipase A₂, sPLA2), которая индуцируется воспалительными цитокинами [20]. Продукты, образующиеся в результате активности sPLA2, участвуют в повреждении нервных клеток при ИИ. В эксперименте было показано, что подавление активности sPLA2 приводит к снижению выраженности оксидативного стресса и степени повреждения гематоэнцефалического барьера [21].

Таким образом, исследования, направленные на изучение прогностической значимости лабораторных тестов и их оценки в качестве биомаркеров, ввиду недостаточности и противоречивости существующей информации продолжают оставаться актуальными и востребованными. Обнаруженные биомаркеры позволят по мере накопления знаний детализировать критерии назначения того или иного вида терапии, провести своевременную подготовку к возможным осложнениям, что, несомненно, повысит эффективность лечения больных с ИИ.

Цель исследования – изучить прогностическую значимость белков острой фазы воспаления и произвести их оценку в качестве ранних предикторов развития пневмонии у пациентов с ИИ.

Материалы и методы

В проспективное исследование включены 302 пациента в остром периоде ИИ.

Критерии включения: острый ИИ, подтвержденный методами нейровизуализации; поступление в 1-е сутки от начала развития болезни; отсутствие острых и хронических заболеваний в стадии декомпенсации.

Критерии исключения: геморрагический инсульт, транзиторная ишемическая атака, острые и хронические заболевания в стадии декомпенсации.

Выборка была представлена пожилыми пациентами с избыточной массой тела и сердечно-сосудистой патологией различного рода, с полушарным ИИ и состоянием средней степени тяжести. Средняя длительность госпитализации составила 26 сут. Клиническая характеристика участников исследования представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Общая клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование / Table 1. General clinical characteristics of patients included in the study

Показатель		Значение
Всего, n (% от n)		302 (100)
Пол, n (% от n):	Муж.	164 (54,3; 48,7–60)
	Жен.	138 (45,7; 40,1–51,3)
Возраст, лет		69,4 (50–88)
Индекс массы тела, кг/м2		27,7 (27,0–29,8)
Систолическое артериальное давление, мм рт. ст.		152,1 (Q 139–174)
Диастолическое артериальное давление, мм рт. ст.		78,6 (Q 74,4–91)
Частота сердечных сокращений, уд/мин		78,3 (75,4–82,4)
Частота дыхания, в мин		16 (Q 15–19)
Локализация поражения, n (% от n):	Полушария	284 (94; 91,1–96,5)
	Ствол	18 (6; 4,7–10,1)
Сопутствующие заболевания, n (% от n)	Артериальная гипертензия	252 (83,4; 79–87,4)
	Ишемическая болезнь сердца	106 (35,1; 29,8–40,6)
	Нарушения ритма сердца	194 (64,2; 58,8–69,5)
	Хроническая сердечная недостаточность	73 (24,2; 19,5–29,2)
	Инфаркт миокарда в анамнезе	54 (17,9; 13,8–22,4)
	Инсульты в анамнезе	63 (20,9; 16,5–25,6)
	Сахарный диабет	66 (21,9; 17,4–26,7)
	Заболевания периферических сосудов	29 (9,6; 6,5–13,2)
Балл по NIHSS		11,0 (Q 6–20)
Объем очага, см3		13,9 (Q 2,8–48,8)
Патогенетический вариант инсульта, n (% от n)	Атеротромботический	93 (28,5; 23,5–33,7)
	Кардиоэмболический	85 (27,5; 22,6–32,7)
	Другой этиологии	136 (44; 38,5–50)

Примечание. Q – значения нижнего и верхнего квартилей.

 

Всем пациентам проводилась стандартная базисная терапия в соответствии с порядками и стандартами оказания медицинской помощи. По показаниям осуществлялась специализированная реперфузионная терапия: тромболизис препаратом рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (recombinant tissue plasminogen activator – rt-PA), тромбоэкстракция или их сочетание.

На госпитальном этапе пневмония развилась у 82 из 302 пациентов (27,2%; 95% доверительный интервал – ДИ 22,3–32,3%). По данным литературы, пневмония взаимосвязана с летальностью и тромботическими осложнениями [22]. Медиана дожития по наличию пневмонии составила 15 (95% ДИ 6,93–28,6) сут, при корректировке на наличие тромботических осложнений – 11,0 (95% ДИ 2,25–15,4) сут.

В исследовании определяли лабораторные показатели, представленные в табл. 2. В качестве референтных использовали значения, указанные производителем набора реагентов.

 

Таблица 2. Перечень провоспалительных лабораторных маркеров, использованных в исследовании / Table 2. List of pro-inflammatory laboratory markers used in the study

Лабораторный тест	Производитель набора реагентов	Референтные значения, ед. изм.
СРБ	Bender MedSystems (Австрия)	136–800 мг/л
ФНО-α	Bender MedSystems (Австрия)	<5 пг/мл
ИЛ-6	Bender MedSystems (Австрия)	1,1–14,3 пг/мл
НЭ	Bender MedSystems (Австрия)	29–86 нг/мл
Неоптерин	IBL (Германия)	<10 нмоль/л
SAA	Invitrogen (США)	10–400 нг/мл
sPLA2	Cayman Chemical (США)	25–100 пг/мл

 

Венозную кровь забирали в 1-е сутки от начала развития ИИ в пробирки с активатором свертывания/этилендиаминтетрауксусной кислотой/цитратом натрия в соответствии с инструкцией к набору. Через 30 мин после взятия крови пробирки центрифугировали в течение 15 мин при 1500 g, сыворотку/плазму крови аликвотировали и замораживали при -70ºС. Уровни лабораторных показателей определяли методом иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного спектрофотометра ASYS ExpertPlus (Великобритания).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программного обеспечения SPSS и Microsoft Excel (США). Описательная статистика непрерывных количественных данных после анализа нормальности распределения представлена в виде среднего значения (M) и 95% ДИ (95% ДИ 2,5–97,5%) при нормальном распределении; в виде медианы (Md) и значений 25% нижнего и 75% верхнего квартилей (Q 25–75%) – при распределении, отличном от нормального. Нормальным принималось распределение, у которого критерий отличия Колмогорова–Смирнова от теоретически нормального распределения был >0,05. Аналитическая статистика для количественных данных с нормальным распределением выполнялась с использованием t-теста Стьюдента; для количественных данных с распределением, отличным от нормального, – при помощи критерия суммы рангов Манна–Уитни. Значение вероятности р<0,05 (двусторонняя проверка) демонстрировало статистическую значимость. ДИ для частот и долей рассчитывали методом Уилсона с учетом объема выборки и поправки на непрерывность. Поиск пороговых значений лабораторных маркеров в прогнозе развития пневмонии выполняли методом ROC-анализа. Чувствительность и специфичность пороговых значений определяли по таблице значений и координатам рабочей характеристической кривой (ROC-кривой). Их точность как классификаторов оценивали по площади под ROC-кривой. Прогностичность положительных и отрицательных результатов пороговых значений по развитию пневмонии оценивали с использованием таблицы сопряженности. Анализ рисков проводили методом «латинского квадрата» с расчетом отношения шансов (ОШ) и дополнительных рисков. Значимость переменных в моделях их влияния на бинарные страты изучали методом пошагового логистического регрессионного анализа. Значение вероятности Р_Rlog<0,05 демонстрировало статистическую значимость. Степень и векторность влияния оценивали по значениям экспоненты регрессионного коэффициента В (ExpB = ОШ), представляющего собой ОШ вероятности бинарного события с учетом 95% ДИ.

Соответствие принципам этики. Работа выполнена в рамках исследования «Лабораторные биомаркеры в прогнозе осложнений и исходов ишемического инсульта», одобренного локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова», протокол №178, 22.10.2018. Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской конвенции.

Результаты

Распределение всех лабораторных показателей значимо отличалось от нормального. Вне зависимости от распределения средние значения и медианы как меры центральной тенденции уровней НЭ, СРБ, ФНО-α, sPLA2 и неоптерина в общей выборке были повышены относительно референтных интервалов. Описательная статистика исследуемых лабораторных показателей представлена в табл. 3.

 

Таблица 3. Описательная статистика провоспалительных лабораторных маркеров, использованных в исследовании (в общей выборке) / Table 3. Descriptive statistics of pro-inflammatory laboratory markers used in the study (in the total sample)

Лабораторный тест	Хср	CD	Md	Q (25–75%)	pKS
НЭ, нг/мл	218	181,1	144	88,7–309	<0,001
СРБ, мг/л	1399	181	1281	800–2027	0,001
ИЛ-6, пг/мл	4,50	834	3,00	1,27–5,61	<0,001
ФНО-α, пг/мл	46,3	5,70	43,6	35,2–54,0	<0,001
sPLA2, пг/мл	7345	25,8	3369	1397–9955	<0,001
SAA, нг/мл	124	24,5	80,3	71,3–159	<0,001
Неоптерин, нмоль/л	13,9	7,6	11,7	6,9–12,2	<0,001

Примечание. X_ср – среднее значение, CD – стандартное отклонение, p^KS – статистическая значимость отличия от нормального распределения.

 

Применение статистических критериев сравнения по наличию и отсутствию пневмонии не выявило значимых различий только уровней НЭ и ФНО-α. Несмотря на то, что содержание остальных провоспалительных маркеров по этим критериям значимо различалось, при сравнении ДИ, в частности квартилей, использованных в качестве ДИ сравнения, ввиду ненормальности распределения значимых различий не обнаружено (табл. 4).

 

Таблица 4. Уровни провоспалительных лабораторных маркеров в 1-е сутки заболевания у пациентов с ИИ с наличием и отсутствием пневмонии / Table 4. Levels of pro-inflammatory laboratory markers on the 1st day of illness in patients with ischemic stroke and the presence or absence of pneumonia

Лабораторный тест	Развитие пневмонии				р
	Нет		Да
	Md	Q (25–75%)	Md	Q (25–75%)
НЭ, нг/мл	127,7	81,2–372,0	161,9	112,5–221,0	0,526
СРБ, мг/л	1171	733–1712	1967	1097–2500	0,005
ИЛ-6, пг/мл	2,38	1,00–5,32	5,41	3,95–7,31	0,002
ФНО-α, пг/мл	45,1	35,5–56,0	46,3	37,0–56,8	0,615
sPLA2, пг/мл	2317	1066–5303	4360	2488–11798	0,020
SAA, нг/мл	77,90	70,50–150,63	85,20	78,50–180,00	0,046
Неоптерин, нмоль/л	9,60	5,60–12,00	12,10	11,69–12,30	0,001

 

Последующее использование пошагового логистического регрессионного анализа позволило установить значимость в прогнозе развития пневмонии исходных значений концентрации ИЛ-6 и СРБ: ОШ 1,63 (1,22–2,17; Р_Rlog=0,001) и 1,001 (1,000–1,002; Р_Rlog=0,019) соответственно. Для них с использованием ROC-анализа были рассчитаны пороговые значения и их характеристики.

Площадь под характеристической кривой в прогнозе развития пневмонии для ИЛ-6 составила 0,747 (95% ДИ 0,655–0,839; р<0,001), что соответствует уровню хорошего классификатора [23]. Пороговое значение по координатам характеристической кривой находилось в пределах референтных значений и составило 3,45 пг/мл с чувствительностью 82,4% и специфичностью 66,7% (рис. 1, a). Прогностическая ценность положительного результата (ПЦПР) порогового значения концентрации ИЛ-6 в прогнозе развития пневмонии составила 40%, отрицательного результата (ПЦОР) – 92%.

 

Рис. 1. Характеристическая кривая (a) и кривые риска Каплана–Мейера (b) концентрации ИЛ-6 по развитию пневмонии. / Fig. 1. Characteristic curve (a) and Kaplan–Meyer risk curves (b) of interleukin-6 concentration for the development of pneumonia.

 

Риск развития пневмонии при концентрации ИЛ-6 >3,45 пг/мл, рассчитанный по таблице сопряженности: ОШ 7,71 (95% ДИ 3,09–19,24; р<0,001).

Кривые риска Каплана–Мейера по группам наличия и отсутствия пневмонии значимо расходились в сторону увеличения частоты развития пневмонии по мере увеличения концентрации ИЛ-6 (рис. 1, b) по раннему критерию Бреслау (р<0,001) и позднему лог-ранговому критерию (р<0,001).

Площадь под характеристической кривой в прогнозе развития пневмонии по концентрации СРБ оказалась равна 0,677 (95% ДИ 0,572–0,783; р=0,001), что соответствует классификатору среднего уровня. Пороговое значение по координатам характеристической кривой было выше референтного предела и составило 1640 мг/л с чувствительностью 65,8% и специфичностью 74,8% (рис. 2, a). ПЦПР порогового значения концентрации СРБ в прогнозе развития пневмонии составила 45%, ПЦОР – 80%.

 

Рис. 2. Характеристическая кривая (a) и кривые риска Каплана–Мейера (b) концентрации СРБ по развитию пневмонии. / Fig. 2. Characteristic curve (a) and Kaplan–Meyer risk curves (b) of CRP concentration for the development of pneumonia.

 

Риск развития пневмонии при концентрации СРБ >1640 мг/л составил: ОШ 5,71 (95% ДИ 2,61–12,5; р<0,001).

Кривые риска Каплана–Мейера по группам наличия и отсутствия пневмонии также значимо расходились по мере увеличении концентрации СРБ (см. рис. 2, b) по раннему критерию Бреслау (р=0,002) и позднему лог-ранговому критерию (р=0,004).

Обсуждение

Как видно из представленных результатов исследования, значения 5 из 7 лабораторных тестов по мерам центральной тенденции превысили верхнюю границу референтного интервала. Причем уровни 2 (sPLA2, ФНО-α) из этих 5 лабораторных тестов были выше верхней границы в 8 и более раз. Обращает на себя внимание, что наиболее значимые изменения при сравнении полученных ДИ лабораторных тестов с их референтными интервалами по отсутствию пересечения данных интервалов обнаружились для sPLA2, ФНО-α, СРБ, НЭ, что указывает на выраженную активацию воспалительных процессов в ответ на повреждение нервных клеток и эндотелия вследствие оксидативного стресса.

При этом большинство маркеров воспаления не продемонстрировали своей значимости в прогнозе развития пневмонии в модели пошаговой логистической регрессии наступления нежелательного события – развития пневмонии. Прогностическая значимость установлена для 2 показателей – СРБ и ИЛ-6, и это позволяет идентифицировать их в качестве провоспалительных предикторов пневмонии при ИИ. Причем уровень ИЛ-6, находился в референтных пределах, что диктует настоятельную необходимость пересмотра референтных значений концентрации ИЛ-6, поскольку выявленное пороговое значение оказалось хорошим классификатором в прогнозе развития пневмонии и не может являться одним из значений референтного интервала.

Определение в качестве биомаркеров развития пневмонии молекул, которые являются в организме активными участниками воспалительных процессов (ИЛ-6 и СРБ), закономерно с точки зрения их биологической роли при воспалении и обусловлено их ранней активацией до развития симптомов пневмонии, т.е. предрасположенностью, вызванной, возможно, уже имеющимися воспалительными процессами.

Заключение

Измерение концентрации ИЛ-6 и СРБ в 1-е сутки заболевания ИИ позволяет идентифицировать пациентов с наибольшей предрасположенностью к развитию пневмонии на госпитальном этапе. Раннее определение концентрации СРБ и ИЛ-6 в настоящее время не входит в перечень обязательных мероприятий для пациентов с ИИ, а проводится лишь в отдельных клинических ситуациях. Результаты нашей работы свидетельствуют о необходимости включения показателей СРБ и ИЛ-6 в перечень рутинных лабораторных исследований, которые должны проводиться каждому пациенту с ИИ в 1-е сутки от начала развития заболевания.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова», протокол №178, 22.10.2018. Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской конвенции.

Ethics approval. The study was approved by the local ethics committee of Russian National Research Medical University, Moscow, Russia, protocol No. 178, 10/22/2018. The approval and procedure for the protocol were obtained in accordance with the principles of the Helsinki Convention.

About the authors

Anatoly G. Kochetov

Institute of Laboratory Medicine; Pirogov Russian National Research Medical University

Author for correspondence.
Email: ag_kochetov@dpo-ilm.ru
ORCID iD: 0000-0003-3632-291X

д-р мед. наук, проф., ректор, проф. каф. фармакологии

Russian Federation, Moscow; Moscow

Olga V. Lyang

People’s Friendship University of Russia (RUDN University); Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies

Email: ag_kochetov@dpo-ilm.ru
ORCID iD: 0000-0002-1023-5490

д-р мед. наук, доц. каф. госпитальной терапии, зав. отд-нием клинической лабораторной диагностики 

Russian Federation, Moscow; Moscow

Irina A. Zhirova

People’s Friendship University of Russia (RUDN University)

Email: ag_kochetov@dpo-ilm.ru
ORCID iD: 0000-0002-6621-2052

канд. мед. наук, доц. каф. госпитальной терапии

Russian Federation, Moscow

Oleg O. Ivoylov

People’s Friendship University of Russia (RUDN University)

Email: ag_kochetov@dpo-ilm.ru
ORCID iD: 0000-0002-4684-8440

канд. мед. наук, ассистент каф. госпитальной терапии

Russian Federation, Moscow

Rita R. Politidis

People’s Friendship University of Russia (RUDN University)

Email: ag_kochetov@dpo-ilm.ru
ORCID iD: 0000-0002-4228-1694

канд. мед. наук, ассистент каф. госпитальной терапии

Russian Federation, Moscow

Yulia V. Novozhenova

People’s Friendship University of Russia (RUDN University)

Email: ag_kochetov@dpo-ilm.ru
ORCID iD: 0000-0003-4295-8172

ассистент каф. госпитальной терапии

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files